La malattia di Alzheimer (AD) è priva di biomarcatori proteici che riflettono la sua multipla patofisiologia sottostante, ostacolando il progresso della diagnosi e del trattamento. Qui, utilizziamo la proteomica completa per identificare i biomarcatori del liquido cerebrospinale (CSF) che rappresentano un'ampia gamma di patofisiologia dell'AD. La spettrometria di massa multiplex ha identificato rispettivamente circa 3.500 e circa 12.000 proteine nel liquido cerebrospinale dell'AD e nel cervello. L'analisi della rete del proteoma cerebrale ha risolto 44 moduli di biodiversità, 15 dei quali si sovrapponevano al proteoma del liquido cerebrospinale. I marcatori AD del CSF in questi moduli sovrapposti sono ripiegati in cinque gruppi proteici, che rappresentano diversi processi fisiopatologici. Le sinapsi e i metaboliti nel cervello AD diminuiscono, ma il liquido cerebrospinale aumenta, mentre aumentano la mielinizzazione ricca di gliali e i gruppi immunitari nel cervello e nel liquido cerebrospinale. La consistenza e la specificità della malattia delle modifiche del pannello sono state confermate in più di 500 ulteriori campioni di liquido cerebrospinale. Questi gruppi hanno anche identificato sottogruppi biologici nell'AD asintomatico. Nel complesso, questi risultati rappresentano un passo promettente verso strumenti di biomarcatori basati sul web per applicazioni cliniche nell’AD.
La malattia di Alzheimer (AD) è la causa più comune di demenza neurodegenerativa in tutto il mondo ed è caratterizzata da un'ampia gamma di disfunzioni del sistema biologico, tra cui la trasmissione sinaptica, l'immunità mediata dagli gliali e il metabolismo mitocondriale (1-3). Tuttavia, i biomarcatori proteici consolidati si concentrano ancora sul rilevamento delle proteine amiloide e tau e pertanto non possono riflettere questa diversa fisiopatologia. Questi biomarcatori proteici “principali” che vengono misurati in modo più affidabile nel liquido cerebrospinale (CSF) includono (i) il peptide beta amiloide 1-42 (Aβ1-42), che riflette la formazione di placche amiloidi corticali; (ii) tau totale, segno di degenerazione assonale; (iii) fosfo-tau (p-tau), un rappresentante dell'iperfosforilazione patologica del tau (4-7). Sebbene questi biomarcatori del liquido cerebrospinale abbiano notevolmente facilitato il rilevamento di malattie legate alla proteina AD “marcate” (4-7), essi rappresentano solo una piccola parte della complessa biologia alla base della malattia.
La mancanza di diversità fisiopatologica dei biomarcatori di AD ha portato a molte sfide, tra cui (i) l’incapacità di identificare e quantificare l’eterogeneità biologica dei pazienti con AD, (ii) una misurazione insufficiente della gravità e della progressione della malattia, soprattutto nella fase preclinica, e ( iii) lo sviluppo di farmaci terapeutici che non sono riusciti a risolvere completamente tutti gli aspetti del deterioramento neurologico. La nostra dipendenza dalla patologia di riferimento per descrivere l’AD da malattie correlate non fa altro che esacerbare questi problemi. Sempre più evidenze mostrano che la maggior parte degli anziani affetti da demenza presenta più di una caratteristica patologica di declino cognitivo (8). Circa il 90% o più degli individui affetti da patologia AD presentano anche malattie vascolari, inclusioni TDP-43 o altre malattie degenerative (9). Queste elevate percentuali di sovrapposizione patologica hanno sconvolto il nostro attuale quadro diagnostico per la demenza ed è necessaria una definizione fisiopatologica più completa della malattia.
In considerazione dell’urgente necessità di una varietà di biomarcatori di AD, il settore sta adottando sempre più il metodo “omico” basato sul sistema complessivo per scoprire i biomarcatori. L’Alleanza Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance è stata lanciata nel 2014 ed è in prima linea nel programma. Questo sforzo multidisciplinare da parte del National Institutes of Health, del mondo accademico e dell’industria mira a utilizzare strategie basate sul sistema per definire meglio la fisiopatologia dell’AD e sviluppare analisi diagnostiche e strategie di trattamento della biodiversità (10). Nell'ambito di questo progetto, la proteomica di rete è diventata uno strumento promettente per il progresso di biomarcatori sistemici nell'AD. Questo approccio imparziale basato sui dati organizza complessi set di dati di proteomica in gruppi o “moduli” di proteine co-espresse che sono associate a specifici tipi di cellule, organelli e funzioni biologiche (11-13). Sono stati condotti quasi 12 studi di proteomica di rete ricchi di informazioni sul cervello di AD (13-23). Nel complesso, queste analisi indicano che il proteoma della rete cerebrale di AD mantiene un'organizzazione modulare altamente conservata in coorti indipendenti e molteplici regioni corticali. Inoltre, alcuni di questi moduli mostrano cambiamenti riproducibili nell’abbondanza correlata all’AD nei set di dati, riflettendo la fisiopatologia di molteplici malattie. Collettivamente, questi risultati dimostrano un promettente punto di ancoraggio per la scoperta del proteoma della rete cerebrale come biomarcatore di sistema nell'AD.
Per trasformare il proteoma della rete cerebrale di AD in biomarcatori basati sul sistema clinicamente utili, abbiamo combinato la rete derivata dal cervello con l'analisi proteomica del liquido cerebrospinale dell'AD. Questo approccio integrato ha portato all’identificazione di cinque serie promettenti di biomarcatori del liquido cerebrospinale associati a un’ampia gamma di patofisiologia cerebrale, tra cui sinapsi, vasi sanguigni, mielinizzazione, infiammazione e disfunzione delle vie metaboliche. Abbiamo convalidato con successo questi pannelli di biomarcatori attraverso molteplici analisi di replica, inclusi più di 500 campioni di liquido cerebrospinale provenienti da varie malattie neurodegenerative. Queste analisi di validazione includono l’esame di target di gruppo nel liquido cerebrospinale di pazienti con AD asintomatico (AsymAD) o l’evidenza di un accumulo anormale di amiloide in un ambiente cognitivo normale. Queste analisi evidenziano la significativa eterogeneità biologica nella popolazione AsymAD e identificano i marcatori del pannello che potrebbero essere in grado di sottotipizzare gli individui nelle prime fasi della malattia. Nel complesso, questi risultati rappresentano un passo fondamentale nello sviluppo di strumenti di biomarcatori proteici basati su più sistemi in grado di risolvere con successo molte delle sfide cliniche affrontate dall’AD.
Lo scopo principale di questo studio è identificare nuovi biomarcatori del liquido cerebrospinale che riflettono varie fisiopatologie cerebrali che portano all'AD. La Figura S1 delinea la nostra metodologia di ricerca, che include (i) un'analisi completa guidata dai risultati preliminari del liquido cerebrospinale AD e del proteoma cerebrale della rete per identificare più biomarcatori di malattia del liquido cerebrospinale correlati al cervello e (ii) successiva replicazione. Questi biomarcatori si trovano in diversi cerebrospinali indipendenti coorti fluide. La ricerca orientata alla scoperta è iniziata con l'analisi dell'espressione differenziale del liquido cerebrospinale in 20 individui cognitivamente normali e 20 pazienti con AD presso il Centro di ricerca sulla malattia di Alzheimer (ADRC) di Emory Goizueta. La diagnosi di AD è definita come un deterioramento cognitivo significativo in presenza di bassi livelli di Aβ1-42 ed elevati livelli di tau totale e p-tau nel liquido cerebrospinale [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (Tabella S1A). Il controllo (MoCA medio, 26,7 ± 2,2) aveva livelli normali di biomarcatori del liquido cerebrospinale.
Il liquido cerebrospinale umano è caratterizzato da un intervallo dinamico di abbondanza proteica, in cui l'albumina e altre proteine estremamente abbondanti possono impedire il rilevamento delle proteine di interesse (24). Per aumentare la profondità della scoperta delle proteine, abbiamo rimosso le prime 14 proteine altamente abbondanti da ciascun campione di liquido cerebrospinale prima dell'analisi con spettrometria di massa (MS) (24). Un totale di 39.805 peptidi sono stati identificati mediante MS, che sono stati mappati su 3691 proteomi in 40 campioni. La quantificazione delle proteine viene eseguita mediante etichettatura con tag di massa tandem multipli (TMT) (18, 25). Per risolvere i dati mancanti, abbiamo incluso solo quelle proteine che erano state quantificate in almeno il 50% dei campioni nell'analisi successiva, quantificando così alla fine 2875 proteomi. A causa della differenza significativa nei livelli di abbondanza proteica totale, un campione di controllo è stato considerato statisticamente un valore anomalo (13) e non è stato incluso nell'analisi successiva. I valori di abbondanza dei restanti 39 campioni sono stati aggiustati in base all'età, al sesso e alla covarianza del lotto (13-15, 17, 18, 20, 26).
Utilizzando l'analisi statistica t-test per valutare l'espressione differenziale sul set di dati di regressione, questa analisi ha identificato proteine i cui livelli di abbondanza erano significativamente modificati (P <0,05) tra i casi di controllo e di AD (Tabella S2A). Come mostrato nella Figura 1A, l'abbondanza di un totale di 225 proteine nell'AD è stata significativamente ridotta e l'abbondanza di 303 proteine è stata significativamente aumentata. Queste proteine differenzialmente espresse includono diversi marcatori di AD nel liquido cerebrospinale precedentemente identificati, come la proteina tau associata ai microtubuli (MAPT; P = 3,52 × 10−8), il neurofilamento (NEFL; P = 6,56 × 10−3), la proteina 43 correlata alla crescita (GAP43; P = 1,46 × 10−5), proteina legante gli acidi grassi 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), chitinasi 3 come 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), granulina neurale (NRGN; P = 3,43 × 10−4) e fattore di crescita nervosa VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Tuttavia, abbiamo anche identificato altri obiettivi molto importanti, come l'inibitore 1 della dissociazione del GDP (GDI1; P = 1,54 × 10-10) e il legame modulare del calcio 1 correlato a SPARC (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). L'analisi Gene Ontology (GO) di 225 proteine significativamente ridotte ha rivelato strette connessioni con processi dei fluidi corporei come il metabolismo degli steroidi, la coagulazione del sangue e l'attività ormonale (Figura 1B e Tabella S2B). Al contrario, l’aumento significativo della proteina 303 è strettamente correlato alla struttura cellulare e al metabolismo energetico.
(A) Il grafico del vulcano mostra la variazione di piega log2 (asse x) rispetto al valore P statistico -log10 (asse y) ottenuto dal test t, che viene utilizzato per rilevare l'espressione differenziale tra il controllo (CT) e Casi di AD del proteoma del liquido cerebrospinale Di tutte le proteine. Le proteine con livelli significativamente ridotti (P <0,05) nell'AD sono mostrate in blu, mentre le proteine con livelli significativamente aumentati nella malattia sono mostrate in rosso. La proteina selezionata viene etichettata. (B) I termini GO principali relativi alle proteine sono significativamente ridotti (blu) e aumentati (rosso) nell'AD. Mostra i tre termini GO con i punteggi z più alti nei campi dei processi biologici, delle funzioni molecolari e dei componenti cellulari. (C) MS ha misurato il livello MAPT nel campione di liquido cerebrospinale (a sinistra) e la sua correlazione con il livello tau ELISA del campione (a destra). Viene visualizzato il coefficiente di correlazione di Pearson con il relativo valore P. A causa della mancanza di dati ELISA per un caso di AD, queste cifre includono valori per 38 dei 39 casi analizzati. (D) L'analisi dei cluster supervisionata (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) aggiustato P <0,01) sul controllo e il liquido cerebrospinale dell'AD hanno trovato campioni utilizzando le 65 proteine modificate in modo più significativo nel set di dati. Standardizzare, normalizzare.
Il livello proteomico di MAPT è strettamente correlato al livello tau ELISA misurato in modo indipendente (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Figura 1C), supportando la validità della nostra misurazione MS. Dopo la digestione della trypsin a livello della proteina precursore dell'amiloide (APP), i peptidi specifici dell'isoforma mappati al C-terminale di Aβ1-40 e Aβ1-42 non possono essere ionizzati in modo efficiente (27, 28). Pertanto, i peptidi APP che abbiamo identificato non hanno nulla a che fare con i livelli ELISA Aβ1-42. Al fine di valutare l'espressione differenziale di ciascun caso, abbiamo utilizzato proteine espresse differenzialmente con P <0,0001 [tasso di false scoperte (FDR) corretto P <0,01] per eseguire un'analisi dei cluster supervisionata dei campioni (Tabella S2A). Come mostrato nella Figura 1D, queste 65 proteine altamente significative possono raggruppare correttamente i campioni in base allo stato patologico, ad eccezione di un caso di AD con caratteristiche simili al controllo. Di queste 65 proteine, 63 aumentavano nell'AD, mentre solo due (CD74 e ISLR) diminuivano. In totale, queste analisi del liquido cerebrospinale hanno identificato centinaia di proteine nell'AD che potrebbero fungere da biomarcatori della malattia.
Quindi abbiamo eseguito un'analisi di rete indipendente del proteoma cerebrale di AD. La coorte cerebrale di questa scoperta includeva la corteccia prefrontale dorsolaterale (DLPFC) del controllo (n = 10), il morbo di Parkinson (PD; n = 10), casi misti di AD/PD (n = 10) e AD (n = 10). ) Campione. Emery Goizueta ADRC. I dati demografici di questi 40 casi sono stati precedentemente descritti (25) e sono riassunti nella Tabella S1B. Abbiamo utilizzato TMT-MS per analizzare questi 40 tessuti cerebrali e la coorte di replica di 27 casi. In totale, questi due set di dati cerebrali hanno prodotto 227.121 peptidi unici, che sono stati mappati su 12.943 proteomi (25). Solo le proteine quantificate in almeno il 50% dei casi sono state incluse nelle indagini successive. Il set di dati di scoperta finale contiene 8817 proteine quantificate. Regolare i livelli di abbondanza proteica in base all'età, al sesso e all'intervallo post mortem (PMI). L'analisi dell'espressione differenziale del set di dati dopo la regressione ha mostrato che >2000 livelli di proteine erano significativamente modificati [P <0,05, analisi della varianza (ANOVA)] in due o più coorti di malattie. Quindi, abbiamo eseguito un'analisi dei cluster supervisionata basata sulle proteine espresse in modo differenziale e P <0,0001 nei confronti AD/controllo e/o AD/PD (Figura S2, A e B, Tabella S2C). Queste 165 proteine altamente alterate descrivono chiaramente casi di patologia AD dai campioni di controllo e PD, confermando i forti cambiamenti specifici dell'AD nell'intero proteoma.
Abbiamo quindi utilizzato un algoritmo chiamato Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) per eseguire l'analisi di rete sul proteoma cerebrale scoperto, che organizza il set di dati in moduli proteici con modelli di espressione simili (11-13). L'analisi ha identificato 44 moduli (M) proteine co-espresse, ordinate e numerate dalla più grande (M1, n = 1821 proteine) alla più piccola (M44, n = 34 proteine) (Figura 2A e Tabella S2D)). Come accennato in precedenza (13) Calcolare il profilo di espressione rappresentativo o la proteina caratteristica di ciascun modulo e correlarlo con lo stato della malattia e la patologia di AD, ovvero stabilire l'alleanza tra il Registro della malattia di Alzheimer (CERAD) e il punteggio di Braak (Figura 2B). Nel complesso, 17 moduli erano significativamente correlati alla neuropatologia dell'AD (P <0,05). Molti di questi moduli correlati alla malattia sono anche ricchi di marcatori specifici del tipo cellulare (Figura 2B). Come accennato in precedenza (13), l'arricchimento del tipo cellulare viene determinato analizzando la sovrapposizione dei moduli e l'elenco di riferimento dei geni specifici del tipo cellulare. Questi geni derivano da dati pubblicati su neuroni di topo isolati, cellule endoteliali e gliali. Esperimento di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) (29).
(A) Scopri il WGCNA del proteoma cerebrale. (B) Analisi di correlazione media bipeso (BiCor) della proteina firma modulare (il primo componente principale dell'espressione proteica modulare) con caratteristiche neuropatologiche AD (in alto), inclusi i punteggi CERAD (placca Aβ) e Braak (grovigli tau). Le intensità delle correlazioni positive (rosse) e negative (blu) sono mostrate da una mappa termica a due colori e gli asterischi indicano la significatività statistica (P <0,05). Utilizzare il test esatto di Fisher ipergeometrico (FET) (in basso) per valutare l'associazione del tipo cellulare di ciascun modulo proteico. L'intensità dell'ombreggiatura rossa indica il grado di arricchimento del tipo cellulare e l'asterisco indica la significatività statistica (P <0,05). Utilizzare il metodo BH per correggere il valore P derivato dal FET. (C) Analisi GO di proteine modulari. Per ciascun modulo o gruppo di moduli correlato vengono mostrati i processi biologici più strettamente correlati. oligo, oligodendrocita.
Una serie di cinque moduli ricchi di astrociti e microglia strettamente correlati (M30, M29, M18, M24 e M5) hanno mostrato una forte correlazione positiva con la neuropatologia dell'AD (Figura 2B). L'analisi ontologica collega questi moduli gliali con la crescita cellulare, la proliferazione e l'immunità (Figura 2C e Tabella S2E). Anche due moduli gliali aggiuntivi, M8 e M22, sono fortemente sovraregolati nella malattia. M8 è altamente correlato alla via del recettore Toll-like, una cascata di segnali che svolge un ruolo chiave nella risposta immunitaria innata (30). Allo stesso tempo, M22 è strettamente correlato alla modificazione post-traduzionale. M2, che è ricco di oligodendrociti, mostra una forte correlazione positiva con la patologia dell'AD e una connessione ontologica con la sintesi nucleosidica e la replicazione del DNA, indicando una maggiore proliferazione cellulare nelle malattie. Nel complesso, questi risultati supportano l'elevazione dei moduli gliali che abbiamo precedentemente osservato nel proteoma della rete AD (13, 17). Attualmente si è scoperto che molti moduli gliali correlati all'AD nella rete mostrano livelli di espressione più bassi nei casi di controllo e PD, evidenziando la loro specificità della malattia che è elevata nell'AD (Figura S2C).
Solo quattro moduli nel nostro proteoma di rete (M1, M3, M10 e M32) sono fortemente correlati negativamente con la patologia AD (P <0,05) (Figura 2, B e C). Sia M1 che M3 sono ricchi di marcatori neuronali. M1 è altamente correlato ai segnali sinaptici, mentre M3 è strettamente correlato alla funzione mitocondriale. Non c'è evidenza di arricchimento del tipo cellulare per M10 e M32. M32 riflette la connessione tra M3 e il metabolismo cellulare, mentre M10 è altamente correlato alla crescita cellulare e alla funzione dei microtubuli. Rispetto all'AD, tutti e quattro i moduli risultano aumentati nel controllo e nella PD, conferendo loro cambiamenti di AD specifici della malattia (Figura S2C). Nel complesso, questi risultati supportano la ridotta abbondanza di moduli ricchi di neuroni che abbiamo precedentemente osservato nell'AD (13, 17). In sintesi, l’analisi di rete del proteoma cerebrale che abbiamo scoperto ha prodotto moduli alterati specificamente per l’AD coerenti con le nostre scoperte precedenti.
L'AD è caratterizzato da uno stadio precoce asintomatico (AsymAD), in cui gli individui mostrano un accumulo di amiloide senza declino cognitivo clinico (5, 31). Questa fase asintomatica rappresenta una finestra critica per la diagnosi precoce e l’intervento. Abbiamo precedentemente dimostrato una forte conservazione modulare del proteoma della rete cerebrale AsymAD e AD attraverso set di dati indipendenti (13, 17). Per garantire che la rete cerebrale attualmente scoperta fosse coerente con questi risultati precedenti, abbiamo analizzato la conservazione di 44 moduli nel set di dati replicati di 27 organizzazioni DLPFC. Queste organizzazioni includono casi di controllo (n = 10), AsymAD (n = 8) e AD (n = 9). I campioni di controllo e di AD sono stati inclusi nell'analisi della nostra coorte di cervelli di scoperta (Tabella S1B), mentre i casi di AsymAD erano unici solo nella coorte di replica. Anche questi casi di AsymAD provenivano dalla banca dei cervelli Emory Goizueta ADRC. Sebbene la cognizione fosse normale al momento della morte, i livelli di amiloide erano anormalmente alti (CERAD medio, 2,8 ± 0,5) (Tabella S1B).
L'analisi TMT-MS di questi 27 tessuti cerebrali ha portato alla quantificazione di 11.244 proteomi. Questo conteggio finale include solo le proteine quantificate in almeno il 50% dei campioni. Questo set di dati replicati contiene 8638 (98,0%) delle 8817 proteine rilevate nella nostra analisi del cervello scoperta e ha quasi 3000 proteine significativamente modificate tra le coorti di controllo e AD (P <0,05, dopo il test t accoppiato di Tukey per l'analisi della varianza) ( Tabella S2F). Tra queste proteine espresse in modo differenziale, 910 hanno mostrato anche cambiamenti di livello significativi tra i casi di controllo di AD e di proteoma cerebrale (P <0,05, dopo il t-test accoppiato ANOVA Tukey). Vale la pena notare che questi 910 marcatori sono altamente coerenti nella direzione del cambiamento tra i proteomi (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Figura S3A). Tra le proteine aumentate, le proteine con le modifiche più consistenti tra i set di dati sono principalmente membri dei moduli M5 e M18 ricchi di gliali (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 e GFAP). Tra le proteine ridotte, quelle con i cambiamenti più consistenti erano quasi esclusivamente membri del modulo M1 (NPTX2, VGF e RPH3A) associato alla sinapsi. Abbiamo ulteriormente verificato i cambiamenti correlati all'AD di midkine (MDK), CD44, proteina 1 correlata al frizzled secreta (SFRP1) e VGF mediante western blotting (Figura S3B). L'analisi di conservazione dei moduli ha mostrato che circa l'80% dei moduli proteici (34/44) nel proteoma cerebrale erano significativamente conservati nel set di dati di replica (punteggio z> 1,96, P corretto FDR <0,05) (Figura S3C). Quattordici di questi moduli erano appositamente riservati tra i due proteomi (punteggio z> 10, P corretto FDR <1,0 × 10−23). Nel complesso, la scoperta e la replica dell'alto grado di coerenza nell'espressione differenziale e nella composizione modulare del proteoma cerebrale evidenzia la riproducibilità dei cambiamenti nelle proteine della corteccia frontale dell'AD. Inoltre, ha anche confermato che AsymAD e le malattie più avanzate hanno una struttura della rete cerebrale molto simile.
Un'analisi più dettagliata dell'espressione differenziale nel set di dati di replicazione del cervello evidenzia il grado significativo di cambiamenti della proteina AsymAD, tra cui un totale di 151 proteine significativamente modificate tra AsymAD e il controllo (P <0,05) (Figura S3D). Coerentemente con il carico di amiloide, l’APP nel cervello di AsymAD e AD è aumentata in modo significativo. Il MAPT cambia in modo significativo solo nell'AD, il che è coerente con l'aumento dei livelli di grovigli e la sua nota correlazione con il declino cognitivo (5, 7). I moduli ricchi di gliali (M5 e M18) si riflettono fortemente nell'aumento delle proteine in AsymAD, mentre il modulo M1 correlato ai neuroni è il più rappresentativo delle proteine diminuite in AsymAD. Molti di questi marcatori AsymAD mostrano maggiori cambiamenti nelle malattie sintomatiche. Tra questi marcatori c'è SMOC1, una proteina gliale appartenente a M18, associata ai tumori cerebrali e allo sviluppo degli occhi e degli arti (32). MDK è un fattore di crescita legante l'eparina correlato alla crescita cellulare e all'angiogenesi (33), un altro membro di M18. Rispetto al gruppo di controllo, AsymAD è aumentato in modo significativo, seguito da un aumento maggiore di AD. Al contrario, la proteina sinaptica neuropentraxina 2 (NPTX2) era significativamente ridotta nel cervello AsymAD. NPTX2 è stato precedentemente associato alla neurodegenerazione e ha un ruolo riconosciuto nella mediazione delle sinapsi eccitatorie (34). Nel complesso, questi risultati rivelano una varietà di diversi cambiamenti proteici preclinici nell'AD che sembrano progredire con la gravità della malattia.
Dato che abbiamo raggiunto una significativa profondità di copertura proteica nella scoperta del proteoma cerebrale, stiamo cercando di comprendere più pienamente la sua sovrapposizione con il trascrittoma di AD a livello di rete. Pertanto, abbiamo confrontato il proteoma cerebrale che abbiamo scoperto con il modulo che abbiamo precedentemente generato dalla misurazione del microarray di 18.204 geni nei tessuti DLPFC di AD (n = 308) e di controllo (n = 157) (13). sovrapposizione. In totale, abbiamo identificato 20 diversi moduli di RNA, molti dei quali hanno dimostrato l'arricchimento di specifici tipi di cellule, inclusi neuroni, oligodendrociti, astrociti e microglia (Figura 3A). Le molteplici modifiche di questi moduli in AD sono mostrate nella Figura 3B. Coerentemente con la nostra precedente analisi di sovrapposizione proteina-RNA utilizzando il proteoma MS più profondo e senza etichetta (circa 3000 proteine) (13), la maggior parte dei 44 moduli nella rete del proteoma cerebrale che abbiamo trovato si trovano nella rete del trascrittoma. Non vi è alcuna sovrapposizione significativa. Dopo la nostra scoperta e replicazione dei 34 moduli proteici altamente trattenuti nel proteoma cerebrale, solo 14 (~40%) hanno superato il test esatto di Fisher (FET) e hanno dimostrato di avere una sovrapposizione statisticamente significativa con il trascrittoma (Figura 3A). Compatibile con la riparazione del danno al DNA (P-M25 e P-M19), la traduzione delle proteine (P-M7 e P-M20), il legame/splicing dell'RNA (P-M16 e P-M21) e il targeting delle proteine (P-M13 e P- M23) non si sovrappone ai moduli del trascrittoma. Pertanto, sebbene nell'attuale analisi di sovrapposizione venga utilizzato un set di dati sul proteoma più profondo (13), la maggior parte del proteoma della rete AD non è mappata sulla rete del trascrittoma.
(A) La FET ipergeometrica dimostra l'arricchimento di marcatori specifici del tipo cellulare nel modulo RNA del trascrittoma dell'AD (in alto) e il grado di sovrapposizione tra i moduli dell'RNA (asse x) e delle proteine (asse y) del cervello dell'AD (metter il fondo a) . L'intensità dell'ombreggiatura rossa indica il grado di arricchimento dei tipi di cellule nel pannello superiore e l'intensità della sovrapposizione dei moduli nel pannello inferiore. Gli asterischi indicano la significatività statistica (P <0,05). (B) Il grado di correlazione tra i geni caratteristici di ciascun modulo trascrittomico e lo stato di AD. I moduli a sinistra sono quelli maggiormente correlati negativamente con l'AD (blu) e quelli a destra sono quelli maggiormente correlati positivamente con l'AD (rosso). Il valore P corretto per BH trasformato in logaritmo indica il grado di significatività statistica di ciascuna correlazione. (C) Moduli sovrapposti significativi con arricchimento di tipo cellulare condiviso. (D) Analisi di correlazione del cambiamento di piega log2 della proteina etichettata (asse x) e dell'RNA (asse y) nel modulo sovrapposto. Viene visualizzato il coefficiente di correlazione di Pearson con il relativo valore P. Micro, microglia; corpi celesti, astrociti. TAC, controllo.
La maggior parte dei moduli proteici e RNA sovrapposti condividono profili di arricchimento del tipo cellulare simili e direzioni di cambiamento AD coerenti (Figura 3, B e C). In altre parole, il modulo M1 correlato alla sinapsi del proteoma cerebrale (PM1) è mappato su tre moduli di RNA omologhi ricchi di neuroni (R-M1, R-M9 e R-M16), che sono nell'AD. Entrambi hanno mostrato un livello ridotto. Allo stesso modo, i moduli proteici M5 e M18 ricchi di gliali si sovrappongono a moduli di RNA ricchi di astrociti e marcatori microgliali (R-M3, R-M7 e R-M10) e sono altamente coinvolti nell'aumento delle malattie. Queste caratteristiche modulari condivise tra i due set di dati supportano ulteriormente l’arricchimento del tipo cellulare e i cambiamenti correlati alla malattia che abbiamo osservato nel proteoma cerebrale. Tuttavia, abbiamo osservato molte differenze significative tra i livelli di RNA e proteine dei singoli marcatori in questi moduli condivisi. L'analisi di correlazione dell'espressione differenziale della proteomica e della trascrittomica delle molecole all'interno di questi moduli sovrapposti (Figura 3D) evidenzia questa incoerenza. Ad esempio, APP e diverse altre proteine del modulo gliale (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 e SFRP1) hanno mostrato un aumento significativo nel proteoma di AD, ma non vi è stato quasi alcun cambiamento nel trascrittoma di AD. Questi cambiamenti proteina-specifici possono essere strettamente correlati alle placche amiloidi (23, 35), evidenziando il proteoma come fonte di cambiamenti patologici, e questi cambiamenti potrebbero non riflettersi nel trascrittoma.
Dopo aver analizzato in modo indipendente i proteomi del cervello e del liquido cerebrospinale che abbiamo scoperto, abbiamo condotto un'analisi completa dei due set di dati per identificare i biomarcatori del liquido cerebrospinale dell'AD correlati alla fisiopatologia della rete cerebrale. Dobbiamo prima definire la sovrapposizione dei due proteomi. Sebbene sia ampiamente accettato che il liquido cerebrospinale rifletta i cambiamenti neurochimici nel cervello dell'AD (4), l'esatto grado di sovrapposizione tra il cervello dell'AD e il proteoma del liquido cerebrospinale non è chiaro. Confrontando il numero di prodotti genici condivisi rilevati nei nostri due proteomi, abbiamo scoperto che quasi il 70% (n = 1936) delle proteine identificate nel liquido cerebrospinale erano quantificate anche nel cervello (Figura 4A). La maggior parte di queste proteine sovrapposte (n = 1721) sono mappate su uno dei 44 moduli di coespressione del set di dati cerebrali della scoperta (Figura 4B). Come previsto, i sei moduli cerebrali più grandi (da M1 a M6) hanno mostrato la maggiore sovrapposizione del liquido cerebrospinale. Tuttavia, esistono moduli cerebrali più piccoli (ad esempio M15 e M29) che raggiungono un grado di sovrapposizione inaspettatamente elevato, più grandi di un modulo cerebrale il doppio delle sue dimensioni. Questo ci motiva ad adottare un metodo più dettagliato e basato sulla statistica per calcolare la sovrapposizione tra il cervello e il liquido cerebrospinale.
(A e B) Le proteine rilevate nel cervello scoperto e nei set di dati CSF si sovrappongono. La maggior parte di queste proteine sovrapposte sono associate a uno dei 44 moduli di coespressione della rete di coespressione del cervello. (C) Scoprire la sovrapposizione tra il proteoma del liquido cerebrospinale e il proteoma della rete cerebrale. Ciascuna riga della mappa termica rappresenta un'analisi di sovrapposizione separata del FET ipergeometrico. La riga superiore raffigura la sovrapposizione (ombreggiatura grigia/nera) tra il modulo cerebrale e l'intero proteoma del liquido cerebrospinale. La seconda riga mostra che la sovrapposizione tra i moduli cerebrali e la proteina del liquido cerebrospinale (ombreggiata in rosso) è significativamente sovraregolata nell'AD (P <0,05). La terza riga mostra che la sovrapposizione tra i moduli cerebrali e la proteina del liquido cerebrospinale (ombreggiatura blu) è significativamente sottoregolata nell'AD (P <0,05). Utilizzare il metodo BH per correggere il valore P derivato dal FET. (D) Pannello del modulo pieghevole basato sull'associazione del tipo di cella e sui relativi termini GO. Questi pannelli contengono un totale di 271 proteine correlate al cervello, che hanno un'espressione differenziale significativa nel proteoma del liquido cerebrospinale.
Utilizzando FET a coda singola, abbiamo valutato l'importanza della sovrapposizione proteica tra il proteoma del liquido cerebrospinale e i singoli moduli cerebrali. L'analisi ha rivelato che un totale di 14 moduli cerebrali nel set di dati CSF presentano sovrapposizioni statisticamente significative (P aggiustato FDR <0,05) e un modulo aggiuntivo (M18) la cui sovrapposizione è vicina al significato (P aggiustato FDR = 0,06) (Figura 4C , riga superiore). Siamo anche interessati a moduli che si sovrappongono fortemente alle proteine CSF differenzialmente espresse. Pertanto, abbiamo applicato due ulteriori analisi FET per determinare quale tra (i) la proteina CSF era significativamente aumentata nell'AD e (ii) la proteina CSF era significativamente diminuita nell'AD (P <0,05, t test AD/controllo accoppiato). Moduli cerebrali con sovrapposizione significativa tra loro. Come mostrato nelle righe centrale e inferiore della Figura 4C, queste analisi aggiuntive mostrano che 8 dei 44 moduli cerebrali si sovrappongono in modo significativo con la proteina aggiunta nel liquido cerebrospinale dell'AD (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 e M38) . ), mentre solo due moduli (M6 e M15) hanno mostrato una sovrapposizione significativa con la proteina ridotta nel liquido cerebrospinale dell'AD. Come previsto, tutti i 10 moduli sono tra i 15 moduli con la maggiore sovrapposizione con il proteoma del liquido cerebrospinale. Pertanto, presumiamo che questi 15 moduli siano fonti ad alto rendimento di biomarcatori del liquido cerebrospinale derivati dal cervello di AD.
Abbiamo piegato questi 15 moduli sovrapposti in cinque grandi pannelli proteici in base alla loro vicinanza nel diagramma ad albero WGCNA e alla loro associazione con i tipi cellulari e l'ontologia genetica (Figura 4D). Il primo pannello contiene moduli ricchi di marcatori neuronali e proteine correlate alle sinapsi (M1 e M12). Il pannello sinaptico contiene un totale di 94 proteine e i livelli nel proteoma del liquido cerebrospinale sono cambiati in modo significativo, rendendolo la più grande fonte di marcatori del liquido cerebrospinale correlati al cervello tra i cinque pannelli. Il secondo gruppo (M6 e M15) ha dimostrato la stretta connessione con i marcatori delle cellule endoteliali e del corpo vascolare, come la “guarigione delle ferite” (M6) e la “regolazione della risposta immunitaria umorale” (M15). M15 è anche altamente correlato al metabolismo delle lipoproteine, che è strettamente correlato all'endotelio (36). Il pannello vascolare contiene 34 marcatori del liquido cerebrospinale correlati al cervello. Il terzo gruppo comprende moduli (M2 e M4) che sono significativamente correlati ai marcatori degli oligodendrociti e alla proliferazione cellulare. Ad esempio, i termini ontologici di livello superiore di M2 includono “regolazione positiva della replicazione del DNA” e “processo di biosintesi delle purine”. Nel frattempo, quelli di M4 includono la “differenziazione delle cellule gliali” e la “segregazione cromosomica”. Il pannello di mielinizzazione contiene 49 marcatori del liquido cerebrospinale correlati al cervello.
Il quarto gruppo contiene il maggior numero di moduli (M30, M29, M18, M24 e M5) e quasi tutti i moduli sono significativamente ricchi di marcatori di microglia e astrociti. Similmente al pannello di mielinizzazione, anche il quarto pannello contiene moduli (M30, M29 e M18) strettamente correlati alla proliferazione cellulare. Gli altri moduli di questo gruppo sono altamente correlati a termini immunologici, come “processo di effetto immunitario” (M5) e “regolazione della risposta immunitaria” (M24). Il gruppo immunitario gliale contiene 42 marcatori del liquido cerebrospinale correlati al cervello. Infine, l'ultimo pannello comprende 52 marcatori correlati al cervello sui quattro moduli (M44, M3, M33 e M38), tutti presenti sul corpo e correlati all'accumulo di energia e al metabolismo. Il più grande di questi moduli (M3) è strettamente correlato ai mitocondri ed è ricco di marcatori specifici dei neuroni. M38 è uno dei membri del modulo più piccoli in questo metaboloma e mostra anche una moderata specificità neuronale.
Nel complesso, questi cinque pannelli riflettono un'ampia gamma di tipi e funzioni cellulari nella corteccia di AD e contengono collettivamente 271 marcatori del liquido cerebrospinale correlati al cervello (Tabella S2G). Per valutare la validità di questi risultati della SM, abbiamo utilizzato il test di estensione di prossimità (PEA), una tecnologia basata su anticorpi ortogonali con capacità di multiplexing, elevata sensibilità e specificità, e abbiamo rianalizzato i campioni di liquido cerebrospinale che abbiamo trovato. Un sottoinsieme di questi 271 biomarcatori (n = 36). Questi 36 obiettivi dimostrano il cambiamento nel multiplo AD della PEA, che è strettamente correlato ai nostri risultati basati sulla SM (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), che hanno fortemente verificato i risultati della nostra analisi completa sulla SM (Figura S4 ).
I temi biologici enfatizzati dai nostri cinque gruppi, dalla segnalazione sinaptica al metabolismo energetico, sono tutti legati alla patogenesi dell'AD (1-3). Pertanto, tutti i 15 moduli contenenti questi pannelli sono correlati alla patologia AD nel proteoma cerebrale che abbiamo scoperto (Figura 2B). La più notevole è l'elevata correlazione patologica positiva tra i nostri moduli gliali e la forte correlazione patologica negativa tra i nostri moduli neuronali più grandi (M1 e M3). L'analisi dell'espressione differenziale del nostro proteoma cerebrale replicato (Figura S3D) evidenzia anche le proteine gliali derivate da M5 e M18. Nell'AsymAD e nell'AD sintomatico, le proteine gliali più aumentate e le sinapsi correlate a M1 sono quelle più ridotte. Queste osservazioni indicano che i 271 marcatori del liquido cerebrospinale che abbiamo identificato nei cinque gruppi sono correlati ai processi patologici nella corteccia di AD, compresi quelli che si verificano nelle prime fasi asintomatiche.
Per analizzare meglio la direzione del cambiamento delle proteine del pannello nel cervello e nel liquido spinale, abbiamo disegnato quanto segue per ciascuno dei 15 moduli sovrapposti: (i) abbiamo trovato il livello di abbondanza del modulo nel set di dati del cervello e (ii) il modulo proteina La differenza è espressa nel liquido cerebrospinale (Figura S5). Come accennato in precedenza, il WGCNA viene utilizzato per determinare l'abbondanza del modulo o il valore proteico caratteristico nel cervello (13). La mappa del vulcano viene utilizzata per descrivere l'espressione differenziale delle proteine modulari nel liquido cerebrospinale (AD/controllo). Queste cifre mostrano che tre dei cinque pannelli mostrano diverse tendenze di espressione nel cervello e nel liquido spinale. I due moduli del pannello sinapsi (M1 e M12) mostrano una diminuzione del livello di abbondanza nel cervello di AD, ma si sovrappongono significativamente con l'aumento delle proteine nel liquido cerebrospinale di AD (Figura S5A). I moduli correlati ai neuroni contenenti il metaboloma (M3 e M38) hanno mostrato modelli di espressione simili nel cervello e nel liquido cerebrospinale incoerenti (Figura S5E). Anche il pannello vascolare ha mostrato tendenze di espressione diverse, sebbene i suoi moduli (M6 e M15) fossero moderatamente aumentati nel cervello AD e diminuiti nel liquido cerebrospinale malato (Figura S5B). I restanti due pannelli contengono grandi reti gliali le cui proteine sono costantemente sovraregolate in entrambi i compartimenti (Figura S5, C e D).
Tieni presente che queste tendenze non sono comuni a tutti gli indicatori di questi pannelli. Ad esempio, il pannello sinaptico comprende diverse proteine che sono significativamente ridotte nel cervello di AD e nel liquido cerebrospinale (Figura S5A). Tra questi marcatori del liquido cerebrospinale down-regolati vi sono NPTX2 e VGF di M1 e la cromogranina B di M12. Tuttavia, nonostante queste eccezioni, la maggior parte dei nostri marcatori sinaptici sono elevati nel liquido spinale dell'AD. Nel complesso, queste analisi sono state in grado di distinguere tendenze statisticamente significative nei livelli del cervello e del liquido cerebrospinale in ciascuno dei nostri cinque pannelli. Queste tendenze evidenziano la relazione complessa e spesso diversa tra l’espressione delle proteine nel cervello e nel liquido cerebrospinale nell’AD.
Quindi, abbiamo utilizzato l'analisi di replicazione della MS ad alto rendimento (replicazione del CSF 1) per restringere il nostro set di 271 biomarcatori agli obiettivi più promettenti e riproducibili (Figura 5A). La copia 1 del liquido cerebrospinale contiene un totale di 96 campioni di Emory Goizueta ADRC, inclusi controllo, AsymAD e coorte AD (Tabella S1A). Questi casi di AD sono caratterizzati da un lieve declino cognitivo (MoCA medio, 20,0 ± 3,8) e cambiamenti nei biomarcatori di AD confermati nel liquido cerebrospinale (Tabella S1A). Contrariamente all'analisi del liquido cerebrospinale che abbiamo riscontrato, questa replicazione viene eseguita utilizzando un metodo MS "single-shot" più efficiente e ad alto rendimento (senza frazionamento off-line), compreso un protocollo di preparazione del campione semplificato che elimina la necessità di immunodeplezione dei singoli campioni . Invece, un singolo “canale di potenziamento” immunodepleto viene utilizzato per amplificare il segnale delle proteine meno abbondanti (37). Sebbene riduca la copertura totale del proteoma, questo metodo a colpo singolo riduce significativamente il tempo della macchina e aumenta il numero di campioni marcati con TMT che possono essere analizzati vitali (17, 38). In totale, l'analisi ha identificato 6.487 peptidi, che corrispondevano a 1.183 proteomi in 96 casi. Come abbiamo riscontrato con l'analisi del liquido cerebrospinale, solo le proteine quantificate in almeno il 50% dei campioni sono state incluse nei calcoli successivi e i dati sono stati regrediti per gli effetti di età e sesso. Ciò ha portato alla quantificazione finale di 792 proteomi, il 95% dei quali sono stati identificati anche nel set di dati CSF trovato.
(A) Bersagli proteici del liquido cerebrospinale correlati al cervello verificati nella prima coorte di liquido cerebrospinale replicato e inclusi nel pannello finale (n = 60). (Da B a E) Livelli di biomarcatori del pannello (punteggi z compositi) misurati nelle quattro coorti di replicazione del liquido cerebrospinale. Sono stati utilizzati t-test per dati appaiati o ANOVA con la post-correzione di Tukey per valutare la significatività statistica delle variazioni di abbondanza in ciascuna analisi replicata. TAC, controllo.
Poiché siamo particolarmente interessati a verificare i nostri 271 target del liquido cerebrospinale correlati al cervello attraverso un'analisi completa, limiteremo l'ulteriore esame di questo proteoma replicato a questi marcatori. Tra queste 271 proteine, 100 sono state rilevate nella replicazione 1 del CSF. La Figura S6A mostra l'espressione differenziale di questi 100 marcatori sovrapposti tra i campioni di controllo e di replicazione di AD. Gli istoni sinaptici e i metaboliti aumentano maggiormente nell’AD, mentre le proteine vascolari diminuiscono maggiormente nella malattia. La maggior parte dei 100 marcatori sovrapposti (n = 70) hanno mantenuto la stessa direzione di cambiamento nei due set di dati (Figura S6B). Questi 70 marcatori convalidati del liquido cerebrospinale correlati al cervello (Tabella S2H) riflettono in gran parte le tendenze di espressione del pannello precedentemente osservate, ovvero la sottoregolazione delle proteine vascolari e la sovraregolazione di tutti gli altri pannelli. Solo 10 di queste 70 proteine convalidate hanno mostrato cambiamenti nell'abbondanza di AD che contraddicevano queste tendenze del pannello. Al fine di generare un pannello che rifletta al meglio l'andamento generale del cervello e del liquido cerebrospinale, abbiamo escluso queste 10 proteine dal pannello di interesse che abbiamo infine verificato (Figura 5A). Pertanto, il nostro pannello include in definitiva un totale di 60 proteine verificate in due coorti indipendenti di AD sul liquido cerebrospinale utilizzando diverse preparazioni dei campioni e analisi della piattaforma MS. I grafici dell'espressione del punteggio z di questi pannelli finali nel controllo della copia 1 del CSF e nei casi di AD hanno confermato la tendenza del pannello osservata nella coorte di CSF che abbiamo trovato (Figura 5B).
Tra queste 60 proteine, ci sono molecole note per essere associate all'AD, come l'osteopontina (SPP1), che è una citochina proinfiammatoria che è stata associata all'AD in molti studi (39-41), e GAP43, una proteina sinaptica che è chiaramente legato alla neurodegenerazione (42). Le proteine più pienamente verificate sono marcatori correlati ad altre malattie neurodegenerative, come la superossido dismutasi 1 (SOD1) correlata alla sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la desaccarasi correlata alla malattia di Parkinson (PARK7). Abbiamo anche verificato che molti altri marcatori, come SMOC1 e la proteina 1 di segnalazione dell'attaccamento della membrana ricca di cervello (BASP1), hanno limitato i precedenti collegamenti con la neurodegenerazione. Vale la pena notare che a causa della loro bassa abbondanza complessiva nel proteoma del liquido cerebrospinale, è difficile per noi utilizzare questo metodo di rilevamento single-shot ad alto rendimento per rilevare in modo affidabile MAPT e alcune altre proteine correlate all'AD (ad esempio, NEFL e NRGN ) (43, 44).
Abbiamo quindi controllato questi 60 indicatori del pannello prioritario in tre ulteriori analisi replicate. In CSF Copy 2, abbiamo utilizzato un singolo TMT-MS per analizzare una coorte indipendente di 297 campioni di controllo e AD provenienti da Emory Goizueta ADRC (17). La replicazione 3 del liquido cerebrospinale includeva una rianalisi dei dati TMT-MS disponibili di 120 pazienti di controllo e AD di Losanna, Svizzera (45). Abbiamo rilevato più di due terzi dei 60 indicatori di priorità in ciascun set di dati. Sebbene lo studio svizzero abbia utilizzato diverse piattaforme MS e metodi di quantificazione TMT (45, 46), abbiamo riprodotto fortemente le tendenze del nostro pannello in due analisi ripetute (Figura 5, C e D, e Tabelle S2, I e J). Per valutare la specificità della malattia del nostro gruppo, abbiamo utilizzato la TMT-MS per analizzare il quarto set di dati di replica (replicazione del CSF 4), che includeva non solo casi di controllo (n = 18) e AD (n = 17), ma anche casi di PD ( n = 14)), campioni di SLA (n = 18) e demenza frontotemporale (FTD) (n = 11) (Tabella S1A). Abbiamo quantificato con successo quasi due terzi delle proteine del pannello in questa coorte (38 su 60). Questi risultati evidenziano i cambiamenti specifici dell'AD in tutti e cinque i pannelli di biomarcatori (Figura 5E e Tabella S2K). L'aumento nel gruppo dei metaboliti ha mostrato la più forte specificità per l'AD, seguito dal gruppo mielinizzato e gliale. In misura minore, anche l’FTD mostra un aumento tra questi panel, che potrebbe riflettere potenziali cambiamenti simili nella rete (17). Al contrario, ALS e PD hanno mostrato quasi gli stessi profili di mielinizzazione, gliali e metaboloma del gruppo di controllo. Nel complesso, nonostante le differenze nella preparazione dei campioni, nella piattaforma MS e nei metodi di quantificazione del TMT, queste analisi ripetute mostrano che i marcatori del nostro pannello prioritario presentano cambiamenti specifici dell'AD altamente coerenti in più di 500 campioni unici di liquido cerebrospinale.
La neurodegenerazione dell’AD è stata ampiamente riconosciuta diversi anni prima della comparsa dei sintomi cognitivi, quindi esiste un urgente bisogno di biomarcatori di AsymAD (5, 31). Tuttavia, sempre più evidenze mostrano che la biologia di AsymAD è tutt’altro che omogenea e la complessa interazione tra rischio e resilienza porta a grandi differenze individuali nella successiva progressione della malattia (47). Sebbene utilizzati per identificare i casi di AsymAD, i livelli dei biomarcatori principali del liquido cerebrospinale (Aβ1-42, tau totale e p-tau) non hanno dimostrato di essere in grado di prevedere in modo affidabile chi progredirà verso la demenza (4, 7), indicando di più. necessario includere strumenti olistici di biomarcatori basati su molteplici aspetti della fisiologia cerebrale per stratificare accuratamente il rischio di questa popolazione. Pertanto, abbiamo successivamente analizzato il nostro pannello di biomarcatori convalidati da AD nella popolazione AsymAD della copia 1 del liquido cerebrospinale. Questi 31 casi di AsymAD hanno mostrato livelli anormali di biomarcatori principali (rapporto ELISA Aβ1–42/tau totale, <5,5) e cognizione completa (MoCA medio, 27,1). ± 2,2) (Tabella S1A). Inoltre, tutti gli individui affetti da AsymAD hanno un punteggio di demenza clinica pari a 0, indicando che non vi è evidenza di un declino delle prestazioni cognitive o funzionali quotidiane.
Abbiamo prima analizzato i livelli dei pannelli convalidati in tutte le 96 repliche di CSF 1, inclusa la coorte AsymAD. Abbiamo scoperto che diversi pannelli nel gruppo AsymAD presentavano cambiamenti significativi nell'abbondanza simili ad AD, il pannello vascolare ha mostrato una tendenza al ribasso in AsymAD, mentre tutti gli altri pannelli hanno mostrato una tendenza al rialzo (Figura 6A). Pertanto, tutti i pannelli hanno mostrato una correlazione altamente significativa con l'ELISA Aβ1-42 e i livelli totali di tau (Figura 6B). Al contrario, la correlazione tra il gruppo e il punteggio MoCA è relativamente scarsa. Uno dei risultati più sorprendenti di queste analisi è l’ampia gamma di abbondanze di pannelli nella coorte AsymAD. Come mostrato nella Figura 6A, il livello del panel del gruppo AsymAD solitamente incrocia il livello del panel del gruppo di controllo e del gruppo AD, mostrando una variabilità relativamente elevata. Per esplorare ulteriormente questa eterogeneità di AsymAD, abbiamo applicato l'analisi Multidimensional Scaling (MDS) a 96 casi di replicazione 1 del CSF. L'analisi MDS consente di visualizzare la somiglianza tra i casi in base a determinate variabili nel set di dati. Per questa analisi dei cluster, utilizziamo solo quei marcatori del pannello convalidati che hanno un cambiamento statisticamente significativo (P <0,05, AD/controllo) nel livello del proteoma 1 di scoperta e replicazione del CSF (n = 29) (Tabella S2L). Questa analisi ha prodotto un chiaro raggruppamento spaziale tra i nostri casi di controllo e di AD (Figura 6C). Al contrario, alcuni casi di AsymAD sono chiaramente raggruppati nel gruppo di controllo, mentre altri si trovano nei casi di AD. Per esplorare ulteriormente questa eterogeneità di AsymAD, abbiamo utilizzato la nostra mappa MDS per definire due gruppi di questi casi di AsymAD. Il primo gruppo comprendeva casi AsymAD raggruppati più vicini al controllo (n = 19), mentre il secondo gruppo era caratterizzato da casi AsymAD con un profilo marcatore più vicino ad AD (n = 12).
(A) Il livello di espressione (punteggio z) del gruppo di biomarcatori del CSF in tutti i 96 campioni nella coorte di replicazione 1 del CSF, incluso AsymAD. L'analisi della varianza con la post-correzione di Tukey è stata utilizzata per valutare la significatività statistica delle variazioni dell'abbondanza del pannello. (B) Analisi di correlazione del livello di abbondanza delle proteine del pannello (punteggio z) con il punteggio MoCA e il livello di tau totale nei campioni ELISA Aβ1-42 e CSF copia 1. Viene visualizzato il coefficiente di correlazione di Pearson con il relativo valore P. (C) L'MDS di 96 casi della copia 1 del liquido cerebrospinale era basato sui livelli di abbondanza di 29 marcatori del pannello convalidati, che erano significativamente modificati sia nel set di dati della scoperta che nella copia 1 del liquido cerebrospinale [P <0,05 AD/controllo (CT)]. Questa analisi è stata utilizzata per dividere il gruppo AsymAD in sottogruppi di controllo (n = 19) e AD (n = 12). (D) Il grafico del vulcano mostra l'espressione differenziale di tutte le proteine di replicazione 1 del CSF con variazione di piega log2 (asse x) rispetto al valore P statistico -log10 tra i due sottogruppi AsymAD. I biomarcatori del pannello sono colorati. (E) Il livello di abbondanza di replicazione 1 del liquido cerebrospinale dei biomarcatori del gruppo di selezione è espresso in modo differenziale tra i sottogruppi AsymAD. Per valutare la significatività statistica è stata utilizzata l'analisi post-aggiustata della varianza di Tukey.
Abbiamo esaminato l'espressione proteica differenziale tra questi casi di controllo e AsymAD simili ad AD (Figura 6D e Tabella S2L). La mappa del vulcano risultante mostra che i marcatori di 14 pannelli sono cambiati in modo significativo tra i due gruppi. La maggior parte di questi marcatori sono membri della sinapsi e del metaboloma. Tuttavia, anche SOD1 e il substrato della proteina chinasi C ricca di alanina miristoilata (MARCKS), che sono membri rispettivamente dei gruppi immunitari mielinico e gliale, appartengono a questo gruppo (Figura 6, D ed E). Il pannello vascolare ha anche contribuito con due marcatori che erano significativamente ridotti nel gruppo AsymAD simile ad AD, tra cui la proteina legante AE 1 (AEBP1) e il membro della famiglia del complemento C9. Non c'era alcuna differenza significativa tra il controllo e i sottogruppi AsymAD simili ad AD in ELISA AB1-42 (P = 0,38) e p-tau (P = 0,28), ma c'era effettivamente una differenza significativa nel livello di tau totale (P = 0,0031 ) (Fig. S7). Esistono diversi marcatori del pannello che indicano che i cambiamenti tra i due sottogruppi AsymAD sono più significativi dei livelli totali di tau (ad esempio, YWHAZ, SOD1 e MDH1) (Figura 6E). Nel complesso, questi risultati indicano che il nostro pannello validato può contenere biomarcatori che possono sottotipizzare e potenzialmente stratificare il rischio di pazienti con malattia asintomatica.
C’è un urgente bisogno di strumenti di biomarcatori basati su sistemi per misurare e individuare meglio le varie fisiopatologie alla base dell’AD. Si prevede che questi strumenti non solo cambieranno il nostro quadro diagnostico dell’AD, ma promuoveranno anche l’adozione di strategie di trattamento efficaci e specifiche per il paziente (1, 2). A tal fine, abbiamo applicato un approccio proteomico completo e imparziale al cervello di AD e al liquido cerebrospinale per identificare biomarcatori di liquido cerebrospinale basati sul web che riflettono un'ampia gamma di fisiopatologia cerebrale. La nostra analisi ha prodotto cinque pannelli di biomarcatori del liquido cerebrospinale, che (i) riflettono sinapsi, vasi sanguigni, mielina, disfunzione immunitaria e metabolica; (ii) dimostrare una forte riproducibilità su diverse piattaforme MS; (iii) Mostrare cambiamenti progressivi specifici della malattia durante le fasi iniziali e tardive dell'AD. Nel complesso, questi risultati rappresentano un passo promettente verso lo sviluppo di strumenti di biomarcatori diversi, affidabili e orientati al web per la ricerca sull’AD e le applicazioni cliniche.
I nostri risultati dimostrano l’organizzazione altamente conservata del proteoma della rete cerebrale di AD e supportano il suo utilizzo come ancoraggio per lo sviluppo di biomarcatori basati sul sistema. La nostra analisi mostra che due set di dati TMT-MS indipendenti contenenti cervelli AD e AsymAD hanno una forte modularità. Questi risultati estendono il nostro lavoro precedente, dimostrando la conservazione dei potenti moduli di oltre 2.000 tessuti cerebrali provenienti da più coorti indipendenti nella corteccia frontale, parietale e temporale (17). Questa rete di consenso riflette vari cambiamenti legati alla malattia osservati nella ricerca attuale, tra cui l’aumento dei moduli infiammatori ricchi di gliali e la diminuzione dei moduli ricchi di neuroni. Come la ricerca attuale, questa rete su larga scala presenta anche significativi cambiamenti modulari in AsymAD, mostrando una varietà di diverse fisiopatologie precliniche (17).
Tuttavia, all’interno di questo quadro altamente conservativo basato su un sistema, esiste un’eterogeneità biologica a grana più fine, soprattutto tra gli individui nelle prime fasi dell’AD. Il nostro pannello di biomarcatori è in grado di rappresentare due sottogruppi in AsymAD, che dimostrano la significativa espressione differenziale di più marcatori del liquido cerebrospinale. Il nostro gruppo è stato in grado di evidenziare le differenze biologiche tra questi due sottogruppi, che non erano evidenti a livello dei biomarcatori principali dell’AD. Rispetto al gruppo di controllo, i rapporti Aβ1-42/tau totale di questi individui AsymAD erano anormalmente bassi. Tuttavia, solo i livelli totali di tau erano significativamente differenti tra i due sottogruppi AsymAD, mentre i livelli di Aβ1-42 e p-tau rimanevano relativamente comparabili. Poiché un'elevata tau nel liquido cerebrospinale sembra essere un migliore predittore dei sintomi cognitivi rispetto ai livelli di Aβ1-42 (7), sospettiamo che le due coorti di AsymAD possano avere rischi diversi di progressione della malattia. Data la dimensione limitata del campione del nostro AsymAD e la mancanza di dati longitudinali, sono necessarie ulteriori ricerche per trarre con sicurezza queste conclusioni. Tuttavia, questi risultati indicano che un pannello di liquido cerebrospinale basato sul sistema può migliorare la nostra capacità di stratificare efficacemente gli individui durante la fase asintomatica della malattia.
Nel complesso, i nostri risultati supportano il ruolo di molteplici funzioni biologiche nella patogenesi dell’AD. Tuttavia, il metabolismo energetico disregolato è diventato il tema principale di tutti e cinque i nostri panel di etichettatura convalidati. Le proteine metaboliche, come l'ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1) e la lattato deidrogenasi A (LDHA), sono i biomarcatori sinaptici più validati, indicando che l'aumento del liquido cerebrospinale dell'AD è un sesso altamente riproducibile. I nostri vasi sanguigni e i pannelli gliali contengono anche diversi marcatori coinvolti nel metabolismo delle sostanze ossidative. Questi risultati sono coerenti con il ruolo chiave che i processi metabolici svolgono nell’intero cervello, non solo per soddisfare l’elevata richiesta di energia dei neuroni, ma anche per soddisfare l’elevata richiesta di energia degli astrociti e di altre cellule gliali (17, 48). I nostri risultati supportano prove crescenti che i cambiamenti nel potenziale redox e l’interruzione dei percorsi energetici possono essere il collegamento principale tra diversi processi chiave coinvolti nella patogenesi dell’AD, inclusi i disturbi mitocondriali, l’infiammazione mediata dagli gliali e il danno vascolare (49). Inoltre, i biomarcatori metabolici del liquido cerebrospinale contengono un gran numero di proteine differenzialmente ricche tra il nostro controllo e i sottogruppi AsymAD simili ad AD, suggerendo che l'interruzione di queste vie energetiche e redox può essere critica nella fase preclinica della malattia.
Le diverse tendenze del pannello del cervello e del liquido cerebrospinale che abbiamo osservato hanno anche interessanti implicazioni biologiche. Sinapsi e metabolomi ricchi di neuroni mostrano livelli diminuiti nel cervello di AD e una maggiore abbondanza nel liquido cerebrospinale. Dato che i neuroni sono ricchi di mitocondri produttori di energia nelle sinapsi per fornire energia ai loro numerosi segnali specializzati (50), ci si aspetta la somiglianza dei profili di espressione di questi due gruppi di neuroni. La perdita di neuroni e l'estrusione di cellule danneggiate possono spiegare queste tendenze del pannello cerebrale e del liquido cerebrospinale nelle fasi successive della malattia, ma non possono spiegare i cambiamenti precoci del pannello che osserviamo (13). Una possibile spiegazione per questi risultati nella malattia asintomatica precoce è la potatura sinaptica anormale. Nuove prove in modelli murini suggeriscono che la fagocitosi sinaptica mediata dalla microglia può essere attivata in modo anomalo nell'AD e portare a una perdita precoce di sinapsi nel cervello (51). Questo materiale sinaptico scartato può accumularsi nel liquido cerebrospinale, motivo per cui osserviamo l'aumento del liquido cerebrospinale nel pannello neuronale. La potatura sinaptica immunomediata può anche spiegare parzialmente l’aumento delle proteine gliali che osserviamo nel cervello e nel liquido cerebrospinale durante tutto il processo patologico. Oltre alla potatura sinaptica, le anomalie complessive nella via esocitica possono anche portare a diverse espressioni dei marcatori neuronali nel cervello e nel liquido cerebrospinale. Numerosi studi hanno dimostrato che il contenuto degli esosomi nella patogenesi del cervello con AD è cambiato (52). Anche la via extracellulare è coinvolta nella proliferazione dell'Aβ (53, 54). Vale la pena notare che la soppressione della secrezione esosomale può ridurre la patologia simile all'AD nei modelli murini transgenici dell'AD (55).
Allo stesso tempo, la proteina nel pannello vascolare ha mostrato un aumento moderato nel cervello AD, ma è diminuita significativamente nel liquido cerebrospinale. La disfunzione della barriera ematoencefalica (BBB) può in parte spiegare questi risultati. Molti studi indipendenti post-mortem sull'uomo hanno dimostrato la rottura della BBB nell'AD (56, 57). Questi studi hanno confermato varie attività anomale che circondano questo strato ermeticamente sigillato di cellule endoteliali, tra cui la perdita dei capillari cerebrali e l'accumulo perivascolare di proteine trasportate dal sangue (57). Ciò può fornire una spiegazione semplice per l’aumento delle proteine vascolari nel cervello, ma non può spiegare completamente l’esaurimento di queste stesse proteine nel liquido cerebrospinale. Una possibilità è che il sistema nervoso centrale stia isolando attivamente queste molecole per risolvere il problema dell’aumento dell’infiammazione e dello stress ossidativo. La riduzione di alcune delle proteine più gravi del liquido cerebrospinale in questo gruppo, in particolare quelle coinvolte nella regolazione delle lipoproteine, è correlata all'inibizione di livelli dannosi di infiammazione e al processo neuroprotettivo delle specie reattive dell'ossigeno. Questo vale per la paroxonasi 1 (PON1), un enzima legante le lipoproteine responsabile della riduzione dei livelli di stress ossidativo nella circolazione (58, 59). Il precursore dell'alfa-1-microglobulina/bikunina (AMBP) è un altro marcatore significativamente sottoregolato del gruppo vascolare. È il precursore del trasportatore dei lipidi bikunin, che è anche coinvolto nella soppressione dell'infiammazione e nella protezione neurologica (60, 61).
Nonostante varie ipotesi interessanti, l’incapacità di rilevare direttamente i meccanismi biochimici delle malattie è una limitazione ben nota dell’analisi proteomica guidata dalla scoperta. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per definire con sicurezza i meccanismi alla base di questi pannelli di biomarcatori. Per procedere verso lo sviluppo di analisi cliniche basate sulla SM, la direzione futura richiede anche l’uso di metodi quantitativi mirati per la verifica dei biomarcatori su larga scala, come il monitoraggio delle reazioni selettive o parallele (62). Recentemente abbiamo utilizzato il monitoraggio delle reazioni parallele (63) per convalidare molti dei cambiamenti proteici del liquido cerebrospinale qui descritti. Diversi obiettivi del pannello prioritario sono quantificati con notevole accuratezza, tra cui YWHAZ, ALDOA e SMOC1, che si mappano rispettivamente ai nostri pannelli di sinapsi, metabolismo e infiammazione (63). Anche l’acquisizione indipendente dei dati (DIA) e altre strategie basate sulla MS possono essere utili per la verifica del target. Bud et al. (64) È stato recentemente dimostrato che esiste una significativa sovrapposizione tra i biomarcatori di AD identificati nel nostro set di dati di scoperta del liquido cerebrospinale e il set di dati indipendente DIA-MS, che consiste di quasi 200 campioni di liquido cerebrospinale provenienti da tre diverse coorti europee. Questi studi recenti supportano il potenziale dei nostri pannelli di trasformarsi in un rilevamento affidabile basato sulla SM. Anche il rilevamento tradizionale basato su anticorpi e aptameri è importante per l’ulteriore sviluppo di biomarcatori chiave dell’AD. A causa della bassa abbondanza di liquido cerebrospinale, è più difficile rilevare questi biomarcatori utilizzando metodi MS ad alto rendimento. NEFL e NRGN sono due esempi di biomarcatori del liquido cerebrospinale a bassa abbondanza, che sono mappati nel pannello nella nostra analisi completa, ma non possono essere rilevati in modo affidabile utilizzando la nostra strategia unica per la SM. Le strategie di targeting basate su anticorpi multipli, come la PEA, possono promuovere la trasformazione clinica di questi marcatori.
Nel complesso, questo studio fornisce un approccio proteomico unico per l'identificazione e la verifica dei biomarcatori di AD nel liquido cerebrospinale basato su diversi sistemi. L’ottimizzazione di questi pannelli di marcatori in ulteriori coorti di AD e piattaforme di SM potrebbe rivelarsi promettente per far avanzare la stratificazione e il trattamento del rischio di AD. Gli studi che valutano il livello longitudinale di questi pannelli nel tempo sono fondamentali anche per determinare quale combinazione di marcatori stratifica meglio il rischio di malattia precoce e i cambiamenti nella gravità della malattia.
Ad eccezione dei 3 campioni copiati da CSF, tutti i campioni di CSF utilizzati in questo studio sono stati raccolti sotto gli auspici di Emory ADRC o di istituti di ricerca strettamente correlati. In questi studi di proteomica sono stati utilizzati un totale di quattro serie di campioni di liquido cerebrospinale Emory. Si è scoperto che la coorte di CSF conteneva campioni di 20 controlli sani e 20 pazienti con AD. La copia 1 del liquido cerebrospinale include campioni provenienti da 32 controlli sani, 31 individui AsymAD e 33 individui AD. La copia 2 del liquido cerebrospinale contiene 147 controlli e 150 campioni di AD. La coorte 4 di replicazione del liquido cerebrospinale multi-malattia comprendeva 18 controlli, 17 campioni di AD, 19 ALS, 13 PD e 11 FTD. Secondo l'accordo approvato dal Comitato di revisione istituzionale dell'Emory University, tutti i partecipanti allo studio Emory hanno ottenuto il consenso informato. Secondo le linee guida sulle migliori pratiche del National Institute of Aging del 2014 per i centri Alzheimer (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), il liquido cerebrospinale è stato raccolto e conservato mediante puntura lombare. I pazienti di controllo, AsymAD e AD hanno ricevuto una valutazione cognitiva standardizzata presso la Emory Cognitive Neurology Clinic o Goizueta ADRC. I loro campioni di liquido cerebrospinale sono stati analizzati mediante INNO-BIA AlzBio3 Luminex per ELISA Aβ1-42, analisi tau totale e p-tau (65). I valori ELISA vengono utilizzati per supportare la classificazione diagnostica dei soggetti sulla base di criteri di cut-off stabiliti per i biomarcatori dell'AD (66, 67). I dati demografici e diagnostici di base per altre diagnosi di liquido cerebrospinale (FTD, SLA e PD) vengono ottenuti anche da Emory ADRC o da istituti di ricerca affiliati. I metadati riassuntivi per questi casi di Emory CSF possono essere trovati nella Tabella S1A. Le caratteristiche della coorte svizzera di replicazione 3 del CSF sono state precedentemente pubblicate (45).
Il CSF ha trovato il campione. Al fine di aumentare la profondità della nostra scoperta del set di dati del CSF, il consumo immunitario di proteine ad alta abbondanza è stato eseguito prima della trypsinizzazione. In breve, 130 μl di liquido cerebrospinale proveniente da 40 singoli campioni di liquido cerebrospinale e un volume uguale (130 μl) di resina di deplezione proteica High Select Top14 Abundance (Thermo Fisher Scientific, A36372) sono stati collocati in una colonna spin (Thermo Fisher Scientific, A89868) a temperatura ambiente temperatura Incubare). Dopo aver centrifugato per 15 minuti, centrifugare il campione a 1000 g per 2 minuti. È stato utilizzato un dispositivo di filtraggio ultracentrifugo 3K (Millipore, UFC500396) per concentrare il campione di effluente mediante centrifugazione a 14.000 g per 30 minuti. Diluire tutti i volumi del campione a 75 μl con soluzione salina tamponata con fosfato. La concentrazione proteica è stata valutata mediante il metodo dell'acido bicinconinico (BCA) secondo il protocollo del produttore (Thermo Fisher Scientific). Il liquido cerebrospinale immunodepleto (60 μl) di tutti i 40 campioni è stato digerito con lisil endopeptidasi (LysC) e trypsin. In breve, il campione è stato ridotto e alchilato con 1,2 μl di tris-2(-carbossietil)-fosfina 0,5 M e 3 μl di cloroacetamide 0,8 M a 90°C per 10 minuti, quindi sonicato a bagnomaria per 15 minuti. Il campione è stato diluito con 193 μl di tampone di urea 8 M [urea 8 M e NaHPO4 100 mM (pH 8,5)] fino ad una concentrazione finale di urea 6 M. LysC (4,5 μg; Wako) viene utilizzato per la digestione notturna a temperatura ambiente. Il campione è stato quindi diluito in urea 1 M con bicarbonato di ammonio (ABC) 50 mM (68). Aggiungere una quantità uguale (4,5 μg) di trypsin (Promega), quindi incubare il campione per 12 ore. Acidificare la soluzione peptidica digerita fino a una concentrazione finale di acido formico (FA) all'1% e acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1% (66), quindi dissalare con una colonna Sep-Pak C18 da 50 mg (Acque) come descritto sopra (25). . Il peptide è stato quindi eluito in 1 ml di acetonitrile al 50% (ACN). Per standardizzare la quantificazione delle proteine tra lotti (25), aliquote da 100 μl provenienti da tutti i 40 campioni di CSF sono state combinate per generare un campione misto, che è stato poi diviso in cinque campioni di standard interno globale (GIS) (48). Tutti i campioni individuali e gli standard combinati vengono essiccati tramite vuoto ad alta velocità (Labconco).
Il CSF copia il campione. Dayon e colleghi hanno precedentemente descritto la deplezione immunitaria e la digestione dei campioni della copia 3 del liquido cerebrospinale (45, 46). I rimanenti campioni replicati non erano immunodepleti individualmente. Digerire questi campioni non rimossi in trypsin come descritto in precedenza (17). Per ciascuna analisi ripetuta, aliquote da 120 μl del peptide eluito di ciascun campione sono state riunite e divise in aliquote di volume uguale da utilizzare come standard interno globale marcato con TMT (48). Tutti i campioni individuali e gli standard combinati vengono essiccati mediante vuoto ad alta velocità (Labconco). Per potenziare il segnale della proteina CSF a bassa abbondanza, combinando 125 μl di ciascun campione, è stato preparato un campione “potenziato” per ciascuna analisi replicata [ovvero, un campione biologico che imita il campione di ricerca, ma la quantità disponibile è molto più grande (37, 69)] fusi in un campione misto di liquido cerebrospinale (17). Il campione misto è stato quindi immunorimosso utilizzando 12 ml di resina per la rimozione di proteine High Select Top14 Abundance (Thermo Fisher Scientific, A36372), digerito come descritto sopra e incluso nella successiva etichettatura TMT multipla.
Orario di pubblicazione: 27 agosto 2021