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I termofili sono microrganismi che prosperano alle alte temperature. Studiarli può fornire preziose informazioni su come la vita si adatta a condizioni estreme. Tuttavia, è difficile ottenere condizioni di temperatura elevata con i microscopi ottici convenzionali. Sono state proposte diverse soluzioni artigianali basate sul riscaldamento elettrico resistivo locale, ma non esiste una soluzione commerciale semplice. In questo articolo introduciamo il concetto di riscaldamento laser su microscala sul campo visivo del microscopio per fornire temperature elevate per studi termofili mantenendo l'ambiente dell'utente mite. Il riscaldamento su microscala a intensità laser moderata può essere ottenuto utilizzando un substrato rivestito di nanoparticelle d'oro come assorbitore di luce biocompatibile ed efficiente. Vengono discussi i possibili effetti della convezione del fluido su microscala, della ritenzione cellulare e del movimento termoforetico centrifugo. Il metodo è stato dimostrato in due specie: (i) Geobacillus stearothermophilus, un batterio termofilo attivo che si riproduce a circa 65°C, che abbiamo osservato germinare, crescere e nuotare sotto riscaldamento su microscala; (ii) Thiobacillus sp., un archaea ottimamente ipertermofilo. a 80°C. Questo lavoro apre la strada all’osservazione semplice e sicura dei microrganismi termofili utilizzando strumenti di microscopia moderni ed economici.
Nel corso di miliardi di anni, la vita sulla Terra si è evoluta per adattarsi a un’ampia gamma di condizioni ambientali che a volte sono considerate estreme dal nostro punto di vista umano. In particolare, alcuni microrganismi termofili (batteri, archaea, funghi) chiamati termofili prosperano nell'intervallo di temperature compreso tra 45°C e 122°C1, 2, 3, 4. I termofili vivono in vari ecosistemi, come sorgenti idrotermali di acque profonde, sorgenti termali o aree vulcaniche. La loro ricerca ha suscitato molto interesse negli ultimi decenni per almeno due ragioni. In primo luogo, possiamo imparare da loro, ad esempio, come i termofili 5, 6, gli enzimi 7, 8 e le membrane 9 siano stabili a temperature così elevate o come i termofili possano resistere a livelli estremi di radiazioni10. In secondo luogo, costituiscono la base per molte importanti applicazioni biotecnologiche1,11,12 come la produzione di carburante13,14,15,16, la sintesi chimica (diidro, alcoli, metano, amminoacidi, ecc.)17, la bioestrazione18 e biocatalizzatori termostabili7,11, 13. In particolare, la reazione a catena della polimerasi (PCR)19 attualmente ben nota coinvolge un enzima (Taq polimerasi) isolato dal batterio termofilo Thermus acquatico, uno dei primi termofili ad essere scoperto.
Tuttavia, lo studio dei termofili non è un compito facile e non può essere improvvisato in nessun laboratorio biologico. In particolare, i termofili viventi non possono essere osservati in vitro con nessun microscopio ottico standard, nemmeno con le camere di riscaldamento disponibili in commercio, solitamente adatte a temperature fino a 40°C. Dagli anni '90 solo pochi gruppi di ricerca si sono dedicati all'introduzione di sistemi di microscopia ad alta temperatura (HTM). Nel 1994 Glukh et al. La camera di riscaldamento/raffreddamento è stata concepita sulla base dell'utilizzo di una cella Peltier che controlla la temperatura di capillari rettangolari chiusi per mantenere l'anaerobicità 20 . Il dispositivo può essere riscaldato fino a 100 °C a una velocità di 2 °C/s, consentendo agli autori di studiare la motilità del batterio ipertermofilo Thermotoga maritima21. Nel 1999 Horn et al. È stato sviluppato un dispositivo molto simile, sempre basato sull'uso di capillari riscaldati adatti alla microscopia commerciale per studiare la divisione/connessione cellulare. Dopo un lungo periodo di relativa inattività, la ricerca di HTM efficaci è ripresa nel 2012, in particolare in connessione con una serie di articoli del gruppo Wirth che utilizzavano un dispositivo inventato da Horn et al. Quindici anni fa, la motilità di un gran numero di archaea, compresi gli ipertermofili, è stata studiata a temperature fino a 100°C utilizzando capillari riscaldati23,24. Hanno inoltre modificato il microscopio originale per ottenere un riscaldamento più rapido (diversi minuti invece di 35 minuti per raggiungere la temperatura impostata) e ottenere un gradiente di temperatura lineare di oltre 2 cm attraverso il mezzo. Questo dispositivo di modellamento del gradiente di temperatura (TGFD) è stato utilizzato per studiare la mobilità di molti termofili all'interno di gradienti di temperatura a distanze biologicamente rilevanti 24, 25.
Il riscaldamento dei capillari chiusi non è l'unico modo per osservare i termofili vivi. Nel 2012, Kuwabara et al. Sono state utilizzate camere Pyrex usa e getta fatte in casa sigillate con adesivo resistente al calore (Super X2; Cemedine, Giappone). I campioni sono stati posizionati su una piastra riscaldante trasparente disponibile in commercio (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Giappone) in grado di riscaldarsi fino a 110°C, ma non originariamente destinata al bioimaging. Gli autori hanno osservato un'efficiente divisione dei batteri termofili anaerobici (Thermosipho globiformans, tempo di raddoppio 24 minuti) a 65°C. Nel 2020, Pulshen et al. Il riscaldamento efficiente di piastre metalliche commerciali (AttofluorTM, Thermofisher) è stato dimostrato utilizzando due elementi riscaldanti fatti in casa: un coperchio e un tavolino (configurazione ispirata alla macchina PCR). Questa associazione determina una temperatura del liquido uniforme e previene l'evaporazione e la condensa sul fondo del coperchio. L'utilizzo di un O-ring evita gli scambi di gas con l'ambiente. Questo HTM, chiamato Sulfoscope, è stato utilizzato per acquisire immagini del Sulfolobus acidocaldarius a 75°C27.
Una limitazione riconosciuta di tutti questi sistemi era la limitazione all'uso di obiettivi ad aria, poiché qualsiasi immersione in olio non era adatta a temperature così elevate e per l'imaging attraverso campioni trasparenti di spessore > 1 mm. Una limitazione riconosciuta di tutti questi sistemi era la limitazione all'uso di obiettivi ad aria, poiché qualsiasi immersione in olio non era adatta a temperature così elevate e per l'imaging attraverso campioni trasparenti di spessore > 1 mm. L'installazione di tutti questi sistemi è stata organizzata per l'uso di oggetti simili L'immersione in acqua non è sufficiente per una temperatura così elevata e per la visualizzazione dei processi nessuna superficie tolica > 1 mm. Un difetto riconosciuto di tutti questi sistemi era la limitazione all'uso di obiettivi ad aria, poiché qualsiasi immersione in olio non era adatta a temperature così elevate e per la visualizzazione attraverso campioni trasparenti di spessore > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜,任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1 毫米厚的透明样品成像. Una limitazione riconosciuta di tutti questi sistemi è la limitazione dell'utilizzo di uno specchio con aria, poiché qualsiasi immersione in olio non è adatta per l'imaging di campioni trasparenti di spessore > 1 mm a temperature così elevate. L'installazione di tutti i sistemi è garantita dall'uso di oggetti e servizi organici immersione in ambienti molto freddi per la temperatura elevata e la visualizzazione corretta толщиной >1 mm. Uno svantaggio riconosciuto di tutti questi sistemi è l'uso limitato di lenti ad aria, qualsiasi immersione in olio non è adatta a temperature così elevate e alla visualizzazione attraverso campioni trasparenti di spessore >1 mm.Più recentemente, questa limitazione è stata eliminata da Charles-Orzag et al. 28, che ha sviluppato un dispositivo che non fornisce più calore attorno al sistema di interesse, ma piuttosto all'interno del vetro di copertura stesso, ricoperto da un sottile strato trasparente di un resistore in ITO (ossido di indio-stagno). Il coperchio può essere riscaldato fino a 75 °C facendo passare una corrente elettrica attraverso lo strato trasparente. L'autore deve però riscaldare anche la lente dell'obiettivo, ma non più di 65 °C, per non danneggiarla.
Questi lavori mostrano che lo sviluppo di un’efficiente microscopia ottica ad alta temperatura non è stato ampiamente adottato, spesso richiede attrezzature fatte in casa e spesso viene ottenuto a scapito della risoluzione spaziale, il che rappresenta un grave svantaggio dato che i microrganismi termofili non sono più grandi di pochi microrganismi. micrometri. Il volume di riscaldamento ridotto è la chiave per risolvere tre problemi inerenti all'HTM: scarsa risoluzione spaziale, elevata inerzia termica quando il sistema si riscalda e riscaldamento dannoso degli elementi circostanti (olio di immersione, lente dell'obiettivo... o mani dell'utente) a temperature estreme. ).
In questo articolo introduciamo un HTM per l'osservazione termofila che non si basa sul riscaldamento resistivo. Invece, abbiamo ottenuto un riscaldamento localizzato all'interno di una regione limitata del campo visivo del microscopio mediante irradiazione laser di un substrato che assorbe la luce. La distribuzione della temperatura è stata visualizzata utilizzando la microscopia in fase quantitativa (QPM). L’efficacia di questo metodo è dimostrata dal Geobacillus stearothermophilus, un batterio termofilo mobile che si riproduce a circa 65°C e ha un tempo di raddoppiamento breve (circa 20 minuti), e dal Sulfolobus shibatae, un batterio ipertermofilo che cresce in modo ottimale a 80°C (archaea) illustrare. Il normale tasso di replicazione e il nuoto sono stati osservati in funzione della temperatura. Questo laser HTM (LA-HTM) non è limitato dallo spessore del coprioggetto o dalla natura dell'obiettivo (immersione in aria o olio). Ciò consente di utilizzare qualsiasi obiettivo ad alta risoluzione sul mercato. Inoltre, non soffre di riscaldamento lento dovuto all'inerzia termica (raggiunge un riscaldamento istantaneo su scala di millisecondi) e utilizza solo componenti disponibili in commercio. Le uniche nuove preoccupazioni per la sicurezza sono legate alla presenza di potenti raggi laser (in genere fino a 100 mW) all'interno del dispositivo e possibilmente attraverso gli occhi, che richiedono occhiali protettivi.
Il principio di LA-HTM consiste nell'utilizzare un laser per riscaldare il campione localmente all'interno del campo visivo del microscopio (Fig. 1a). Per fare ciò, il campione deve assorbire la luce. Per utilizzare una potenza laser ragionevole (meno di 100 mW), non abbiamo fatto affidamento sull'assorbimento della luce da parte del mezzo liquido, ma abbiamo aumentato artificialmente l'assorbimento del campione rivestendo il substrato con nanoparticelle d'oro (Fig. 1c). Il riscaldamento delle nanoparticelle d'oro con la luce è di fondamentale importanza per il campo della plasmonica termica, con applicazioni previste in biomedicina, nanochimica o raccolta della luce solare29,30,31. Negli ultimi anni abbiamo utilizzato questo LA-HTM in diversi studi relativi alle applicazioni del plasma termico in fisica, chimica e biologia. La principale difficoltà con questo metodo sta nel visualizzare il profilo della temperatura finale, poiché la temperatura elevata è limitata a una regione su microscala all'interno del campione. Abbiamo dimostrato che la mappatura della temperatura può essere ottenuta con l'interferometro a taglio trasversale a quattro lunghezze d'onda, un metodo semplice, ad alta risoluzione e molto sensibile di microscopia di fase quantitativa basato sull'uso di reticoli di diffrazione bidimensionali (noti anche come reticoli a croce) 33,34,35,36. L'affidabilità di questa tecnica di microscopia termica, basata sulla microscopia del fronte d'onda a reticolo incrociato (CGM), è stata dimostrata in una dozzina di articoli pubblicati negli ultimi dieci anni37,38,39,40,41,42,43.
Schema di installazione del microscopio parallelo per riscaldamento, sagomatura e temperatura laser. b Geometria del campione costituita da una camera AttofluorTM contenente un coprioggetto rivestito con nanoparticelle d'oro. c Osservare attentamente il campione (non in scala). d rappresenta il profilo uniforme del raggio laser e (e) la successiva distribuzione simulata della temperatura sul piano campione delle nanoparticelle d'oro. f è un profilo anulare del raggio laser atto a generare una temperatura uniforme come mostrato nella simulazione della distribuzione della temperatura risultante mostrata in (g). Barra della scala: 30 µm.
In particolare, abbiamo recentemente ottenuto il riscaldamento di cellule di mammifero con LA-HTM e CGM e monitorato le risposte allo shock termico cellulare nell'intervallo 37-42°C, dimostrando l'applicabilità di questa tecnica all'imaging di singole cellule viventi. Tuttavia, l’applicazione di LA-HTM allo studio dei microrganismi ad alte temperature non è univoca, in quanto richiede maggiore cautela rispetto alle cellule di mammifero: in primo luogo, riscaldando il fondo del mezzo di decine di gradi (anziché di pochi gradi) si porta ad un forte gradiente termico verticale. può creare convezione del fluido 44 che, se non saldamente attaccato al substrato, può causare movimenti indesiderati e mescolamento di batteri. Questa convezione può essere eliminata riducendo lo spessore dello strato liquido. A questo scopo, in tutti gli esperimenti presentati di seguito, le sospensioni batteriche sono state poste tra due vetrini coprioggetto di circa 15 µm di spessore posti all'interno di una coppetta metallica (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). In linea di principio, la convezione può essere evitata se lo spessore del liquido è inferiore alla dimensione del raggio del laser riscaldante. In secondo luogo, lavorare in una geometria così limitata può soffocare gli organismi aerobici (vedi Fig. S2). Questo problema può essere evitato utilizzando un substrato permeabile all'ossigeno (o qualsiasi altro gas vitale), lasciando bolle d'aria intrappolate all'interno del coprioggetto o praticando dei fori nel coprioggetto superiore (vedere Fig. S1) 45 . In questo studio, abbiamo scelto quest'ultima soluzione (Figure 1b e S1). Infine, il riscaldamento laser non fornisce una distribuzione uniforme della temperatura. Anche alla stessa intensità del raggio laser (Fig. 1d), la distribuzione della temperatura non è uniforme, ma assomiglia piuttosto alla distribuzione gaussiana dovuta alla diffusione termica (Fig. 1e). Quando l'obiettivo è stabilire temperature precise nel campo visivo per lo studio dei sistemi biologici, i profili irregolari non sono ideali e possono anche portare al movimento termoforetico dei batteri se non aderiscono al substrato (vedi Fig. S3, S4)39. A tal fine, abbiamo utilizzato un modulatore spaziale della luce (SLM) per modellare il raggio laser a infrarossi secondo la forma dell'anello (Fig. 1f) nel piano del campione per ottenere una distribuzione della temperatura perfettamente uniforme all'interno di una data area geometrica, nonostante la diffusione termica (Fig. 1d) 39, 42, 46. Posizionare un coprioggetto superiore su un piatto metallico (Figura 1b) per evitare l'evaporazione del mezzo e osservare per almeno alcuni giorni. Poiché il coprioggetto superiore non è sigillato, è possibile aggiungere facilmente ulteriore mezzo in qualsiasi momento, se necessario.
Per illustrare come funziona LA-HTM e dimostrarne l'applicabilità nella ricerca termofila, abbiamo studiato i batteri aerobici Geobacillus stearothermophilus, che hanno una temperatura di crescita ottimale di circa 60-65°C. Il batterio è inoltre dotato di flagelli e della capacità di nuotare, fornendo un altro indicatore della normale attività cellulare.
I campioni (Fig. 1b) sono stati preincubati a 60°C per un'ora e quindi collocati in un portacampioni LA-HTM. Questa pre-incubazione è facoltativa, ma comunque utile, per due motivi: in primo luogo, quando il laser è acceso, fa sì che le cellule crescano e si dividano immediatamente (vedere il film M1 in Materiali supplementari). Senza preincubazione, la crescita batterica viene generalmente ritardata di circa 40 minuti ogni volta che viene riscaldata una nuova area di visualizzazione sul campione. In secondo luogo, la pre-incubazione di 1 ora ha promosso l'adesione dei batteri al vetrino coprioggetto, impedendo alle cellule di uscire dal campo visivo a causa della termoforesi quando il laser era acceso (vedere il film M2 in Materiali supplementari). La termoforesi è il movimento di particelle o molecole lungo un gradiente di temperatura, solitamente dal caldo al freddo, e i batteri non fanno eccezione43,47. Questo effetto indesiderato viene eliminato su una determinata area utilizzando SLM per modellare il raggio laser e ottenere una distribuzione piatta della temperatura.
Nella fig. La Figura 2 mostra la distribuzione della temperatura misurata dal CGM ottenuta irradiando un substrato di vetro rivestito con nanoparticelle d'oro con un raggio laser anulare (Fig. 1f). È stata osservata una distribuzione piatta della temperatura su tutta l'area coperta dal raggio laser. Questa zona è stata impostata a 65°C, la temperatura di crescita ottimale. Al di fuori di questa regione, la curva della temperatura cade naturalmente a \(1/r\) (dove \(r\) è la coordinata radiale).
una mappa di temperatura delle misurazioni CGM ottenuta utilizzando un raggio laser anulare per irradiare uno strato di nanoparticelle d'oro per ottenere un profilo di temperatura piatto su un'area circolare. b Isoterma della mappa della temperatura (a). Il contorno del raggio laser è rappresentato da un cerchio tratteggiato grigio. L'esperimento è stato ripetuto due volte (vedere Materiali supplementari, Figura S4).
La vitalità delle cellule batteriche è stata monitorata per diverse ore utilizzando LA-HTM. Nella fig. 3 mostra l'intervallo di tempo per quattro immagini riprese da un filmato di 3 ore e 20 minuti (Film M3, Informazioni supplementari). È stato osservato che i batteri proliferavano attivamente all'interno dell'area circolare definita dal laser dove la temperatura era ottimale, avvicinandosi ai 65°C. Al contrario, la crescita cellulare veniva significativamente ridotta quando la temperatura scendeva sotto i 50°C per 10 s.
Immagini di profondità ottica dei batteri G. stearothermophilus che crescono dopo il riscaldamento laser in tempi diversi, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, su 200 Estratto da un film di un minuto (film M3 fornito in Informazioni supplementari) sovrapposto alla corrispondente mappa della temperatura. Il laser si accende all'istante \(t=0\). Le isoterme sono state aggiunte all'immagine dell'intensità.
Per quantificare ulteriormente la crescita cellulare e la sua dipendenza dalla temperatura, abbiamo misurato l'aumento della biomassa di varie colonie di batteri inizialmente isolati nel campo visivo Movie M3 (Fig. 4). I batteri genitori selezionati all'inizio della formazione di mini unità formanti colonie (mCFU) sono mostrati nella Figura S6. Le misurazioni della massa secca sono state effettuate con una fotocamera CGM 48 utilizzata per mappare la distribuzione della temperatura. La capacità del CGM di misurare il peso secco e la temperatura è il punto di forza del LA-HTM. Come previsto, l'alta temperatura ha causato una crescita batterica più rapida (Fig. 4a). Come mostrato nel grafico semi-log in Fig. 4b, la crescita a tutte le temperature segue una crescita esponenziale, dove i dati utilizzano la funzione esponenziale \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), dove \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – tempo di generazione (o tempo di raddoppio), \( g =1/ \tau\) – tasso di crescita (numero di divisioni per unità di tempo). Nella fig. 4c mostra il rispettivo tasso di crescita e il tempo di generazione in funzione della temperatura. Le mCFU a crescita rapida sono caratterizzate dalla saturazione della crescita dopo due ore, un comportamento atteso dovuto all'elevata densità batterica (simile alla fase stazionaria nelle classiche colture liquide). La forma generale \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) corrisponde alla curva a due fasi prevista per G. stearothermophilus con un tasso di crescita ottimale intorno a 60-65°C. Abbina i dati utilizzando un modello cardinale (Figura S5)49 dove \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, che ben concorda con altri valori citati in letteratura49. Sebbene i parametri dipendenti dalla temperatura siano riproducibili, il tasso di crescita massimo di \({G}_{0}\) può variare da un esperimento all'altro (vedi figure S7-S9 e filmato M4). Contrariamente ai parametri di adattamento della temperatura, che dovrebbero essere universali, il tasso di crescita massimo dipende dalle proprietà del mezzo (disponibilità di nutrienti, concentrazione di ossigeno) all'interno della geometria della microscala osservata.
a Crescita microbica a varie temperature. mCFU: unità formanti colonie in miniatura. Dati ottenuti da un video di un singolo batterio che cresce in un gradiente di temperatura (filmato M3). b Uguale a (a), scala semilogaritmica. c Tasso di crescita\(\tau\) e tempo di generazione\(g\) calcolati dalla regressione lineare (b). Barre di errore orizzontali: intervallo di temperatura oltre il quale le mCFU si sono espanse nel campo visivo durante la crescita. Barre di errore verticali: errore standard di regressione lineare.
Oltre alla normale crescita, alcuni batteri a volte appaiono alla vista durante il riscaldamento laser, che è un comportamento previsto per i batteri con flagelli. Il filmato M5 nelle informazioni aggiuntive mostra tali attività di nuoto. In questo esperimento, è stata utilizzata una radiazione laser uniforme per creare un gradiente di temperatura, come mostrato nelle Figure 1d, e e S3. La Figura 5 mostra due sequenze di immagini selezionate dal filmato M5 che mostrano che un batterio mostra un movimento direzionale mentre tutti gli altri batteri rimangono immobili.
I due intervalli di tempo (a) e (b) mostrano il nuoto di due diversi batteri contrassegnati da cerchi tratteggiati. Le immagini sono state estratte dal filmato M5 (fornito come materiale supplementare).
Nel caso di G. stearothermophilus, il movimento attivo dei batteri (Fig. 5) è iniziato pochi secondi dopo l'accensione del raggio laser. Questa osservazione enfatizza la risposta temporale di questo microrganismo termofilo all'aumento della temperatura, come già osservato da Mora et al. 24 . Il tema della motilità batterica e persino della termotassi può essere ulteriormente esplorato utilizzando LA-HTM.
Il nuoto microbico non deve essere confuso con altri tipi di movimento fisico, vale a dire (i) il moto browniano, che sembra essere un movimento caotico senza una direzione definita, (ii) la convezione 50 e la termoforesi 43, che consistono in una deriva regolare del movimento lungo una temperatura pendenza.
G. stearothermophilus è noto per la sua capacità di produrre spore altamente resistenti (formazione di spore) se esposto a condizioni ambientali avverse come difesa. Quando le condizioni ambientali ritornano favorevoli, le spore germinano, formando cellule viventi e riprendendo la crescita. Sebbene questo processo di sporulazione/germinazione sia ben noto, non è mai stato osservato in tempo reale. Utilizzando LA-HTM, riportiamo qui la prima osservazione degli eventi di germinazione in G. stearothermophilus.
Nella fig. 6a mostra immagini time-lapse della profondità ottica (OT) ottenute utilizzando un set CGM di 13 spore. Per l'intero tempo di raccolta (15 h 6 min, \(t=0\) – inizio del riscaldamento laser), 4 spore su 13 hanno germinato, in punti temporali successivi \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' e \(11\) h \(30\)'. Sebbene nella Figura 6 sia mostrato solo uno di questi eventi, nel materiale supplementare è possibile osservare 4 eventi di germinazione nel filmato M6. È interessante notare che la germinazione sembra essere casuale: non tutte le spore germinano e non germinano contemporaneamente, nonostante gli stessi cambiamenti nelle condizioni ambientali.
un time-lapse composto da 8 immagini OT (immersione in olio, 60x, obiettivo 1,25 NA) e (b) evoluzione della biomassa degli aggregati di G. stearothermophilus. c (b) Disegnato su scala semi-logaritmica per evidenziare la linearità del tasso di crescita (linea tratteggiata).
Nella fig. 6b,c mostra la biomassa delle popolazioni cellulari nel campo visivo in funzione del tempo durante l'intero periodo di raccolta dei dati. Il rapido decadimento della massa secca osservato a \(t=5\)h in fig. 6b,c, a causa dell'uscita di alcune celle dal campo visivo. Il tasso di crescita di questi quattro eventi è \(0,77\pm 0,1\) h-1. Questo valore è superiore al tasso di crescita associato alla Figura 3.3 e 4, dove le cellule crescono normalmente. La ragione dell'aumento del tasso di crescita di G. stearothermophilus dalle spore non è chiara, ma queste misurazioni evidenziano l'interesse di LA-HTM e lavorano a livello di singola cellula (o a livello di singola mCFU) per saperne di più sulla dinamica della vita cellulare .
Per dimostrare ulteriormente la versatilità di LA-HTM e le sue prestazioni alle alte temperature, abbiamo esaminato la crescita di Sulfolobus shibatae, un archaea acidofilo ipertermofilo con una temperatura di crescita ottimale di 80°C51. Rispetto a G. stearothermophilus, questi archaea hanno anche una morfologia molto diversa, somigliando a sfere di 1 micron (cocchi) piuttosto che a bastoncini allungati (bacilli).
La Figura 7a è costituita da immagini sequenziali di profondità ottica di S. shibatae mCFU ottenute utilizzando CGM (vedere il lungometraggio M7 in Materiali supplementari). Questa mCFU cresce a circa 73°C, al di sotto della temperatura ottimale di 80°C, ma all'interno dell'intervallo di temperature per la crescita attiva. Abbiamo osservato molteplici eventi di fissione che hanno fatto sembrare le mCFU come micrograppi di archaea dopo poche ore. Da queste immagini OT, la biomassa mCFU è stata misurata nel tempo e presentata nella Figura 7b. È interessante notare che le mCFU di S. shibatae hanno mostrato una crescita lineare piuttosto che la crescita esponenziale osservata con le mCFU di G. stearothermophilus. C'è una discussione di lunga data 52 sulla natura dei tassi di crescita cellulare: mentre alcuni studi riportano tassi di crescita dei microbi proporzionali alle loro dimensioni (crescita esponenziale), altri mostrano un tasso costante (crescita lineare o bilineare). Come spiegato da Tzur et al.53, la distinzione tra crescita esponenziale e (bi)lineare richiede una precisione <6% nelle misurazioni della biomassa, che è fuori portata per la maggior parte delle tecniche QPM, anche coinvolgendo l'interferometria. Come spiegato da Tzur et al.53, la distinzione tra crescita esponenziale e (bi)lineare richiede una precisione <6% nelle misurazioni della biomassa, che è fuori portata per la maggior parte delle tecniche QPM, anche coinvolgendo l'interferometria. Come indicato da Cur e dr.53, la ripartizione dell'esposizione e della (bi)linea ha un livello di tolleranza <6% nelle misurazioni biomassa che non è necessaria per il potenziamento del metodo QPM, ma con l'utilizzo dell'interferenza. Come spiegato da Zur et al.53, la distinzione tra crescita esponenziale e (bi)lineare richiede una precisione <6% nelle misurazioni della biomassa, che è irraggiungibile per la maggior parte dei metodi QPM, anche utilizzando l'interferometria.Come spiegato da Zur et al. 53, la distinzione tra crescita esponenziale e (bi)lineare richiede una precisione inferiore al 6% nelle misurazioni della biomassa, che è irraggiungibile per la maggior parte dei metodi QPM, anche quando viene utilizzata l’interferometria. Il CGM raggiunge questa precisione con un'accuratezza inferiore al pg nelle misurazioni della biomassa36,48.
un time-lapse composto da 6 immagini OT (immersione in olio, 60x, obiettivo NA 1,25) e (b) evoluzione della biomassa micro-CFU misurata con CGM. Guarda il film M7 per ulteriori informazioni.
La crescita perfettamente lineare di S. shibatae era inaspettata e non è stata ancora segnalata. Si prevede però una crescita esponenziale, almeno perché nel tempo devono verificarsi divisioni multiple di 2, 4, 8, 16… cellule. Abbiamo ipotizzato che la crescita lineare potrebbe essere dovuta all'inibizione cellulare dovuta al denso impaccamento cellulare, proprio come la crescita cellulare rallenta e alla fine raggiunge uno stato dormiente quando la densità cellulare è troppo elevata.
Concludiamo discutendo a turno i seguenti cinque punti di interesse: riduzione del volume di riscaldamento, riduzione dell'inerzia termica, interesse per le nanoparticelle d'oro, interesse per la microscopia di fase quantitativa e un possibile intervallo di temperature in cui è possibile utilizzare LA-HTM.
Rispetto al riscaldamento resistivo, il riscaldamento laser utilizzato per lo sviluppo HTM offre numerosi vantaggi, che illustriamo in questo studio. In particolare, nei mezzi liquidi nel campo visivo del microscopio, il volume di riscaldamento è mantenuto entro pochi (10 μm) 3 volumi. In questo modo, solo i microbi osservati sono attivi, mentre gli altri batteri sono dormienti e possono essere utilizzati per studiare ulteriormente il campione: non è necessario cambiare il campione ogni volta che è necessario controllare una nuova temperatura. Inoltre, il riscaldamento su microscala consente l'esame diretto di un ampio intervallo di temperature: la Figura 4c è stata ottenuta da un filmato di 3 ore (Movie M3), che di solito richiede la preparazione e l'esame di diversi campioni, uno per ciascuno dei campioni oggetto di studio. y è la temperatura che rappresenta il numero di giorni dell'esperimento. La riduzione del volume riscaldato mantiene inoltre tutti i componenti ottici circostanti del microscopio, in particolare la lente dell'obiettivo, a temperatura ambiente, il che finora è stato uno dei principali problemi affrontati dalla comunità. LA-HTM può essere utilizzato con qualsiasi obiettivo, comprese le lenti a immersione in olio, e rimane a temperatura ambiente anche con temperature estreme nel campo visivo. La principale limitazione del metodo di riscaldamento laser che riportiamo in questo studio è che le cellule che non aderiscono o galleggiano potrebbero essere lontane dal campo visivo e difficili da studiare. Una soluzione alternativa potrebbe essere quella di utilizzare lenti a basso ingrandimento per ottenere un aumento della temperatura maggiore di poche centinaia di micron. Questa cautela è accompagnata da una diminuzione della risoluzione spaziale, ma se l'obiettivo è studiare il movimento dei microrganismi, non è richiesta un'elevata risoluzione spaziale.
La scala temporale per il riscaldamento (e il raffreddamento) del sistema \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{\mbox{D}}}}\) dipende dalle sue dimensioni, secondo la legge \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), dove \ (L\ ) è la dimensione caratteristica della sorgente di calore (il diametro del raggio laser nel nostro studio è \(L\ circa 100\) μm), \(D\) è la diffusività termica dell'ambiente (media nel nostro caso, vetro e acqua Velocità di diffusione\(D\ circa 2\volte {10}^{-7}\) m2/s). Pertanto, in questo studio, risposte temporali dell'ordine di 50 ms, cioè quasi istantanee Questo aumento istantaneo della temperatura non solo riduce la durata dell'esperimento, ma consente anche una tempistica precisa \(t=0\) per qualsiasi studio dinamico degli effetti della temperatura.
Il nostro metodo proposto è applicabile a qualsiasi substrato che assorbe la luce (ad esempio, campioni commerciali con rivestimento ITO). Tuttavia, le nanoparticelle d'oro sono in grado di fornire un elevato assorbimento nell'infrarosso e un basso assorbimento nel campo del visibile, le cui ultime caratteristiche sono interessanti per un'osservazione ottica efficace nel campo del visibile, soprattutto quando si utilizza la fluorescenza. Inoltre, l’oro è biocompatibile, chimicamente inerte, la densità ottica può essere regolata da 530 nm al vicino infrarosso e la preparazione del campione è semplice ed economica29.
La microscopia del fronte d'onda a reticolo trasversale (CGM) consente non solo la mappatura della temperatura su microscala, ma anche il monitoraggio della biomassa, rendendola particolarmente utile (se non necessaria) in combinazione con LA-HTM. Negli ultimi dieci anni sono state sviluppate altre tecniche di microscopia della temperatura, soprattutto nel campo del bioimaging, e la maggior parte di esse richiede l'uso di sonde fluorescenti sensibili alla temperatura54,55. Tuttavia, questi metodi sono stati criticati e alcuni rapporti hanno misurato cambiamenti di temperatura non realistici all'interno delle cellule, probabilmente a causa del fatto che la fluorescenza dipende da molti fattori diversi dalla temperatura. Inoltre, la maggior parte delle sonde fluorescenti sono instabili alle alte temperature. Pertanto, il QPM e in particolare il CGM rappresentano una tecnica di microscopia termica ideale per studiare la vita ad alte temperature utilizzando la microscopia ottica.
Gli studi su S. shibatae, che vive in modo ottimale a 80°C, mostrano che LA-HTM può essere applicato per studiare gli ipertermofili, non solo i semplici termofili. In linea di principio, non vi è alcun limite alla gamma di temperature che possono essere raggiunte utilizzando LA-HTM, e anche temperature superiori a 100°C possono essere raggiunte a pressione atmosferica senza ebollizione, come dimostrato dal nostro gruppo di 38 persone in applicazioni di chimica idrotermale a pressione atmosferica. pressione A. Per riscaldare le nanoparticelle d'oro 40 allo stesso modo viene utilizzato un laser. Pertanto, LA-HTM ha il potenziale per essere utilizzato per osservare ipertermofili senza precedenti con la microscopia ottica standard ad alta risoluzione in condizioni standard (cioè sotto stress ambientale).
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando un microscopio fatto in casa, inclusa illuminazione Köhler (con LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), portacampione con movimento xy manuale, obiettivi (Olympus, 60x, 0,7 NA, aria, LUCPlanFLN60X o 60x, 1,25 NA, olio , UPLFLN60XOI), fotocamera CGM (reticolo incrociato QLSI, passo 39 µm, 0,87 mm dal sensore della fotocamera Andor Zyla) per fornire immagini di intensità e fronte d'onda, e fotocamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, modalità a 16 bit, da Hamamatsu) per registrare il dati mostrati nella Figura 5 (nuoto batterico). Il divisore di fascio dicroico è un BrightLine edge da 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Il filtro sulla parte anteriore della fotocamera è un filtro passa corto 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Laser allo zaffiro e titanio (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, cavità laser tsunami pompato, Spectra-Physics in Fig. 2-5, ulteriormente sostituito dal laser Millenia, Spectraphysics 10 W, cavità laser Mira pompata, Coherent, per Fig. 2 -5). 6 e 7) sono impostati sulla lunghezza d'onda \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, che corrisponde allo spettro di risonanza plasmonica delle nanoparticelle d'oro. Modulatori spaziali della luce (1920 × 1152 pixel) sono stati acquistati da Meadowlark Optics Gli ologrammi sono stati calcolati utilizzando l'algoritmo Gerchberg-Saxton come descritto nel collegamento 39.
La microscopia del fronte d'onda a reticolo incrociato (CGM) è una tecnica di microscopia ottica basata sulla combinazione di un reticolo di diffrazione bidimensionale (noto anche come reticolo a croce) a una distanza di un millimetro dal sensore di una fotocamera convenzionale. L'esempio più comune di CGM che abbiamo utilizzato in questo studio è chiamato interferometro a spostamento trasversale a quattro lunghezze d'onda (QLSI), dove il reticolo incrociato consiste in uno schema a scacchiera intensità/fase introdotto e brevettato da Primot et al. nel 200034. Le linee del reticolo verticale e orizzontale creano ombre a forma di griglia sul sensore, la cui distorsione può essere elaborata numericamente in tempo reale per ottenere la distorsione del fronte d'onda ottico (o profilo di fase equivalente) della luce incidente. Se utilizzata su un microscopio, una telecamera CGM può visualizzare la differenza del percorso ottico di un oggetto ripreso, nota anche come profondità ottica (OT), con una sensibilità dell'ordine dei nanometri36. In qualsiasi misurazione CGM, per eliminare eventuali difetti nei componenti ottici o nei fasci, è necessario acquisire un'immagine OT di riferimento primaria e sottrarla da qualsiasi immagine successiva.
La microscopia della temperatura è stata eseguita utilizzando una fotocamera CGM come descritto nel riferimento. 32. In breve, il riscaldamento di un liquido ne modifica l'indice di rifrazione, creando un effetto lente termica che distorce il fascio incidente. Questa distorsione del fronte d'onda viene misurata dal CGM ed elaborata utilizzando un algoritmo di deconvoluzione per ottenere una distribuzione tridimensionale della temperatura nel mezzo liquido. Se le nanoparticelle d’oro sono distribuite uniformemente in tutto il campione, la mappatura della temperatura può essere eseguita in aree prive di batteri per produrre immagini migliori, che è ciò che facciamo a volte. L'immagine CGM di riferimento è stata acquisita senza riscaldamento (con il laser spento) e successivamente catturata nella stessa posizione dell'immagine con il laser acceso.
La misurazione della massa secca viene ottenuta utilizzando la stessa fotocamera CGM utilizzata per l'imaging della temperatura. Le immagini di riferimento CGM sono state ottenute spostando rapidamente il campione in xey durante l'esposizione come mezzo per calcolare la media di eventuali disomogeneità nell'OT dovute alla presenza di batteri. Dalle immagini OT dei batteri, la loro biomassa è stata ottenuta utilizzando un insieme di immagini su aree selezionate utilizzando l'algoritmo di segmentazione fatto in casa di Matlab (vedere la sottosezione "Codice numerico"), seguendo la procedura descritta nel rif. 48. In breve, usiamo la relazione \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), dove \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) è l'immagine della profondità ottica, \(m\) è il peso a secco e \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) è una costante. Abbiamo scelto \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, che è una costante tipica per le cellule viventi.
Un vetrino coprioggetto di 25 mm di diametro e 150 µm di spessore rivestito con nanoparticelle d'oro è stato posizionato in una camera AttofluorTM (Thermofisher) con le nanoparticelle d'oro rivolte verso l'alto. Geobacillus stearothermophilus è stato precoltivato durante la notte in mezzo LB (200 giri al minuto, 60°C) prima di ogni giorno di esperimenti. Una goccia di 5 µl di una sospensione di G. stearothermophilus con una densità ottica (OD) compresa tra 0,3 e 0,5 è stata posta su un vetrino coprioggetto con nanoparticelle d'oro. Quindi, sulla goccia è stato fatto cadere un vetrino coprioggetto rotondo di 18 mm di diametro con un foro di 5 mm di diametro al centro e al centro del foro sono stati applicati ripetutamente 5 μl di sospensione batterica con la stessa densità ottica. I pozzetti sui vetrini coprioggetto sono stati preparati secondo la procedura descritta nel rif. 45 (vedere Informazioni supplementari per ulteriori informazioni). Quindi aggiungere 1 ml di terreno LB al coprioggetto per evitare che lo strato liquido si secchi. L'ultimo coprioggetto viene posizionato sopra il coperchio chiuso della camera Attofluor™ per impedire l'evaporazione del terreno durante l'incubazione. Per gli esperimenti di germinazione abbiamo utilizzato le spore che, dopo gli esperimenti convenzionali, a volte ricoprivano il coprioggetto superiore. Un metodo simile è stato utilizzato per ottenere Sulfolobus shibatae. Sono stati condotti tre giorni (200 giri al minuto, 75°C) di coltivazione preliminare di Thiobacillus serrata nel terreno 182 (DSMZ).
Campioni di nanoparticelle d'oro sono stati preparati mediante litografia di copolimero a blocchi micellare. Questo processo è descritto in dettaglio nel cap. 60. In breve, le micelle che incapsulano gli ioni oro sono state sintetizzate mescolando il copolimero con HAuCl4 in toluene. I vetrini puliti sono stati poi immersi nella soluzione e trattati con irradiazione UV in presenza di un agente riducente per ottenere semi d'oro. Infine, i semi d'oro sono stati coltivati mettendo a contatto un vetrino coprioggetto con una soluzione acquosa di KAuCl4 ed etanolamina per 16 minuti, il che ha prodotto una disposizione quasi periodica e molto uniforme di nanoparticelle d'oro non sferiche nel vicino infrarosso.
Per convertire gli interferogrammi in immagini OT, abbiamo utilizzato un algoritmo fatto in casa, come dettagliato nel link. 33 ed è disponibile come pacchetto Matlab nel seguente repository pubblico: https://github.com/baffou/CGMprocess. Il pacchetto può calcolare l'intensità e le immagini OT sulla base degli interferogrammi registrati (comprese le immagini di riferimento) e delle distanze delle telecamere.
Per calcolare lo schema di fase applicato a SLM per ottenere un determinato profilo di temperatura, abbiamo utilizzato un algoritmo fatto in casa precedentemente sviluppato39,42 disponibile nel seguente repository pubblico: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. L'ingresso è il campo di temperatura desiderato, che può essere impostato digitalmente o tramite un'immagine bmp monocromatica.
Per segmentare le cellule e misurare il loro peso secco, abbiamo utilizzato il nostro algoritmo Matlab pubblicato nel seguente repository pubblico: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Su ciascuna immagine, l'utente deve fare clic sui batteri o mCFU di interesse, regolare la sensibilità della bacchetta e confermare la selezione.
Per ulteriori informazioni sulla progettazione dello studio, consultare l'abstract del rapporto di ricerca sulla natura collegato a questo articolo.
I dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili presso i rispettivi autori su ragionevole richiesta.
Il codice sorgente utilizzato in questo studio è dettagliato nella sezione Metodi e le versioni di debug possono essere scaricate da https://github.com/baffou/ nei seguenti repository: SLM_temperatureShaping, CGMprocess e CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Approfondimento sui termofili e sulle loro applicazioni ad ampio spettro. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Approfondimento sui termofili e sulle loro applicazioni ad ampio spettro.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. e Sharma, AK Panoramica dei termofili e loro ampia applicazione. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. e Sharma AK Una profonda conoscenza dei termofili e un'ampia gamma di applicazioni.3 Biotecnologie 6, 81 (2016).
Orario di pubblicazione: 26 settembre 2022